Información

4.2: Detección genética de mutaciones - Genética avanzada - Biología

4.2: Detección genética de mutaciones - Genética avanzada - Biología


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Una forma de identificar genes que afectan un proceso biológico particular es inducir mutaciones aleatorias en una gran población y luego buscar mutantes con fenotipos que podrían ser causados ​​por una interrupción de una vía bioquímica particular. Esta estrategia de detección de mutantes se ha utilizado de manera muy eficaz para identificar y comprender los componentes moleculares de cientos de procesos biológicos diferentes. Por ejemplo, para encontrar los procesos biológicos básicos de la memoria y el aprendizaje, los investigadores han examinado poblaciones mutagenizadas de Drosophila para recuperar moscas (o larvas) que carecen de la capacidad normal de aprendizaje. Debido a la similitud de la biología entre todos los organismos, algunos de los genes identificados por esta pantalla mutante de un organismo modelo pueden ser relevantes para el aprendizaje y la memoria en humanos, incluidas afecciones como la enfermedad de Alzheimer.

- Pantallas genéticas

En una pantalla de mutantes típica, los investigadores tratan a una población parental con un mutágeno. Esto puede implicar remojar semillas en EMS o mezclar un mutágeno con la comida que se les da a las moscas. Por lo general, no hay fenotipos visibles entre los individuos que están expuestos directamente al mutágeno porque en todas las células, cada hebra de ADN se verá afectada de forma independiente. Por tanto, las mutaciones inducidas serán heterocigotas y se limitarán a células individuales. Sin embargo, lo más importante para los genetistas son las mutaciones en la línea germinal de los individuos mutagenizados. los línea germinal se define como los gametos y cualquiera de sus precursores del desarrollo y, por lo tanto, es distinto del células somáticas (es decir, células no reproductoras) del cuerpo. Debido a que la mayoría de las mutaciones inducidas son recesivas, la progenie de los individuos mutagenizados debe emparejarse de manera que permita que las nuevas mutaciones se vuelvan homocigóticas (o hemicigóticas). Las estrategias para hacer esto varían de un organismo a otro. En cualquier caso, la generación en la que se espera que ocurran mutaciones inducidas puede examinarse para detectar la presencia de nuevos fenotipos. Una vez que se ha identificado un mutante relevante, los genetistas pueden comenzar a hacer inferencias sobre cuál es la función normal del gen mutado, basándose en su fenotipo mutante. Esto puede investigarse más a fondo con técnicas de genética molecular.

La exposición de un organismo a un mutágeno provoca mutaciones en posiciones esencialmente aleatorias a lo largo de los cromosomas. La mayoría de los fenotipos mutantes recuperados de un cribado genético son causados ​​por pérdida de función mutaciones. Estos alelos se deben a cambios en la secuencia de ADN que hacen que ya no produzca el mismo nivel de proteína activa que el alelo de tipo salvaje. Los alelos con pérdida de función tienden a ser recesivos porque el alelo de tipo salvaje es haplosuficiente (véase el capítulo 3). Un alelo de pérdida de función que no produce proteína activa se llama amorfo, o nulo. Por otro lado, los alelos con solo una pérdida parcial de función se denominan hipomórfico. Más raramente, un alelo mutante puede tener un ganancia de función, produciendo más proteína activa (hipermorfosis) o producir una proteína activa con una nueva función (neomorfo). Finalmente, antimorfo los alelos tienen una actividad dominante y opuesta a la función de tipo salvaje; Los antimorfos también se conocen como dominante negativo mutaciones.


Genética avanzada

Genética avanzada es un enfoque de genética molecular para determinar la base genética responsable de un fenotipo. Los métodos de genética avanzada comienzan con la identificación de un fenotipo y encuentran o crean organismos modelo que muestran la característica que se está estudiando.

Esto se hizo inicialmente mediante el uso de mutaciones naturales o la inducción de mutantes con radiación, sustancias químicas o mutagénesis de inserción (por ejemplo, elementos transponibles). Se lleva a cabo la reproducción posterior, se aíslan los individuos mutantes y luego se mapea el gen. La genética avanzada se puede considerar como un contrapunto a la genética inversa, que determina la función de un gen mediante el análisis de los efectos fenotípicos de las secuencias de ADN alteradas. [1] Los fenotipos mutantes a menudo se observan mucho antes de tener una idea de qué gen es responsable, lo que puede llevar a que los genes reciban el nombre de su fenotipo mutante (p. Ej., Drosophila rosado gen que lleva el nombre del color de ojos en mutantes). [2]


El cribado genético de mujeres CAH no clásicas con hiperandrogenemia identifica una nueva mutación del gen CYP11B1

Objetivo: La hiperplasia suprarrenal congénita (CAH) es un trastorno endocrino autosómico recesivo con varios síntomas de diversa gravedad. La hiperandrogenemia leve es la característica clínica más común en pacientes con CAH no clásica y el 95% de los casos se identifican por mutaciones en el gen CYP21A2. En el presente estudio, se investiga la segunda causa más común de CAH no clásica (NC-CAH), la deficiencia de 11β-hidroxilasa debido a mutaciones en el gen CYP11B1.

Diseño: Se llevó a cabo un cribado de los genes CYP21A2 y CYP11B1 mediante secuenciación directa para la detección de posibles defectos genéticos en pacientes con sospecha de CAH.

Resultados: Se observó que las variantes de CYP11B1 coexisten sólo en casos raros junto con mutaciones en CYP21A2 en pacientes con diagnóstico clínico de CAH. Un total de 23 pacientes femeninas NC-CAH de 75 fueron identificadas con una sola mutación en el gen CYP21A2. La nueva mutación del gen CYP11B1, p.Val484Asp, se identificó en un paciente con CAH en estado heterocigoto. Se descubrió que la caracterización estructural del nuevo p.Val484Asp probablemente causa distorsión de la hoja beta circundante y desestabilización indirecta de la cavidad que ocurre en la cara opuesta de los elementos estructurales, lo que conduce a un deterioro parcial de la actividad enzimática.

Conclusiones: Las mutaciones del gen CYP21A2 son los defectos genéticos más frecuentes en los casos de NC-CAH incluso cuando estos pacientes se encuentran en estado heterocigoto. Estas mutaciones tienen un fenotipo diverso que da lugar a un grado variable de deterioro de la síntesis de cortisol. También está claro que los mutantes CYP11B1 son un tipo raro de defectos que causan CAH.


Resultados

Producción de la población mutante Caméor

Caméor es un cultivo de guisantes de jardín de floración temprana que completa su ciclo reproductivo en cuatro meses, permitiendo tres generaciones sucesivas al año en condiciones de invernadero. Aunque el guisante se autofecunda predominantemente, puede producirse cierta polinización cruzada residual. Para evitar la contaminación, se analizaron 100 plantas de Caméor, derivadas de semillas individuales, para determinar la uniformidad genética utilizando un conjunto de 16 marcadores de repetición de secuencia corta distribuidos en cada brazo de los siete cromosomas de guisante predichos [23] y se dejaron establecer semillas en insectos. invernaderos a prueba. En total, se produjeron 10.000 semillas de Caméor y se utilizaron para crear la población mutante.

Con el fin de equilibrar la densidad de mutación máxima con una tasa de supervivencia de la planta aceptable, primero realizamos un análisis de 'curva de muerte' en lotes de 100 semillas, utilizando un rango de dosis de EMS de 8 a 57 mM. La mayoría de las plantas mutantes de primera generación (M1) tratadas exhibieron un crecimiento retardado en una etapa temprana de plántula, pero todas se recuperaron. Luego se cultivaron treinta plantas de cada tratamiento hasta la madurez y se evaluó la fertilidad y la producción de semillas. Se observó una alta pérdida de fertilidad a las dosis más altas, con menos del 30% de plantas fértiles a dosis superiores a 32 mM EMS. Las dosis más altas de EMS que permitieron que el 50% de las plantas produjeran semillas, 16 mM y 24 mM, se retuvieron y probaron en grandes lotes de semillas (Tabla 1). Se observó poca diferencia entre estas dos dosis con una tendencia hacia una mayor producción de semillas con EMS 16 mM, por lo que se utilizó una dosis final de EMS 20 mM para la producción de la población. El número medio de semillas por vaina también fue ligeramente superior para las plantas tratadas con 16 mM que para las tratadas con 24 mM EMS. La alta tasa de embriones detenidos en vainas de plantas M1 tratadas con dosis de EMS de 16-24 mM atestigua su buena eficacia de mutagénesis. De las 8,600 plantas M1, se cosecharon individualmente más de 4,817 líneas que habían producido más de 5 semillas M2 cada una. Para producir semillas M3, se sembraron cuatro semillas M2 por planta M1 en macetas de dos litros y las semillas M3 se cosecharon de dos plantas hermanas, denominadas A y B. El material de las hojas se cosechó de la planta de aspecto más saludable, denominada A ( Figura 1). Las existencias de semillas se enviaron al centro de existencias de Grain Legumes en Dijon para la multiplicación, distribución y almacenamiento a largo plazo de las líneas.

Establecimiento de una biblioteca de mutantes EMS de guisantes. Las semillas de Caméor fueron mutagenizadas con EMS. De las 8.600 plantas M1 autofecundadas en un invernadero a prueba de insectos, 4.817 produjeron más de 5 M2 semillas cada una. Cuatro semillas M2, denominadas A-D, por parental M1 se cultivaron hasta la madurez y se puntuaron para los fenotipos. El ADN se extrajo de las plantas denominadas A, que se dejaron para formar semillas M3. Como respaldo, se recolectaron semillas M3 de las plantas hermanas B. Las semillas de M3 recolectadas se enviaron al Centro de Recursos Biológicos de Leguminosas de Cereales para su distribución, mantenimiento de las líneas y almacenamiento a largo plazo de la biblioteca mutante.

Fenotipado de la población mutante Caméor

Como teníamos la intención de crear una colección de mutantes de referencia que pudiera usarse para genética directa e inversa, llevamos a cabo un fenotipado sistemático de la población mutante. Nuestra puntuación fenotípica se basó en la caracterización visual de cuatro plantas por familia M2 en etapas clave de desarrollo, desde la germinación hasta la maduración del fruto. Para facilitar la puntuación del fenotipo, definimos una ontología fenotípica adaptada al guisante. Esta herramienta de determinación del fenotipo no cubre todas las alteraciones fenotípicas (por ejemplo, no se llevó a cabo una evaluación de la raíz) y se construyó para la puntuación de alto rendimiento de muchas líneas mutantes en una temporada de crecimiento relativamente corta. El vocabulario utilizado para describir las plantas mutantes se organizó en un árbol jerárquico y se compone de 107 subcategorías de fenotipos agrupados en diferentes niveles. La lista completa del vocabulario utilizado se muestra en el archivo de datos adicional 1 y el número de líneas encontradas en cada categoría de fenotipo principal se muestra en la Tabla 2.

De las 4.817 familias M2, 1.840 mostraron un fenotipo visible, lo que representa el 38% de las líneas. Entre las líneas que mostraron un fenotipo visible, el 45% se puntuó para un solo fenotipo y el 55% mostró múltiples fenotipos, es decir, caen en más de una categoría de fenotipo principal (Figura 2a). Esta tasa de pleiotropía es una subestimación ya que la caracterización fenotípica se basa en una observación visual de alto rendimiento de solo cuatro líneas mutantes por familia M2. La caracterización morfológica y bioquímica detallada de un mayor número de plantas por familia M2 daría como resultado más efectos fenotípicos por mutante y, por tanto, una mayor tasa de pleiotropía. Los fenotipos más comúnmente observados están relacionados con el tamaño del tallo, la arquitectura de la hoja y la planta, seguidos de los relacionados con los cotiledones, las estípulas y las semillas, siendo los fenotipos menos abundantes los relacionados con las flores, la arquitectura de las plántulas y la morfología del pecíolo (Figura 2b). En la Figura 3 se muestran ejemplos de fenotipos correspondientes a las categorías principales descritas.

Distribución de las características fenotípicas de la población mutante y tasa de pleiotropía. (a) Número de familias M2 en cada grupo fenotípico. El eje x indica las nueve categorías fenotípicas principales, enumeradas en la Tabla 2, y el eje y indica el número total de familias M2. Cada barra representa el número de mutantes en la categoría correspondiente. La barra azul representa la cantidad de mutantes pleiotrópicos (que tienen más de un fenotipo), dada por el primer número en la etiqueta de la categoría. La barra roja representa los mutantes no pleiotrópicos y viene dada por el segundo número en la etiqueta de la categoría. (B) Número total de familias M2 (eje y) que comparten de 1 a 5 categorías fenotípicas principales (eje x). La barra para una categoría fenotípica indica cuántos mutantes se clasifican en un solo grupo fenotípico (mutantes no pleiotrópicos), y las barras para las categorías fenotípicas 2-5 representan el número de mutantes que comparten de dos a cinco fenotipos, respectivamente. En cada caso, el número total de mutantes se indica en la parte superior de la barra.

Ejemplos de fenotipos mutantes que representan los nueve grupos fenotípicos principales. (a) Planta 566: color cotiledón, albino. (B) Planta 939: arquitectura de plántulas, arquitectura de plantas tupidas, color de hoja hipercompacto, tamaño de tallo verde pálido, enano extremo. (C) Planta 54: arquitectura vegetal, crecimiento determinado. (D) Planta 1236: arquitectura de la planta, color de la hoja ramificada basal, verde pálido, tamaño de hoja amarillo, tamaño de tallo mediano, enano. (e, f) Planta 903: hoja, en forma de cono en las flores de la base de la hoja, flores estériles. (gramo) Planta 1.567: hoja, estípula distorsionada, argentoso plateado. (h) Planta 630: flores, flores de inflorescencia tipo coliflor, todo tallo anormal, hoja enana, rizado hacia arriba.

Plataforma de labranza Caméor

Para configurar la plataforma Pea TILLING, se prepararon muestras de ADN de 4.704 plantas M2, cada una representando una familia independiente y organizadas en grupos de 8 familias M2. Un factor clave en TILLING es la disponibilidad de la secuencia genómica anotada del gen que se va a cultivar. Aunque aún no se ha secuenciado el genoma del guisante, la adquisición de las secuencias genómicas de los genes diana se ve facilitada por el alto grado de sintenia entre el guisante y la planta modelo. Medicago truncatula, que se está secuenciando [24]. El programa CODDLE (Codones optimizados para descubrir lesiones perjudiciales [25, 26]) combinado con la herramienta PRIMER3 [27] se utilizan para definir el mejor amplicón para TILLING. Los productos de PCR utilizados para TILLING tienen un tamaño máximo de aproximadamente 1500 pb y, por lo tanto, los genes más largos se dividen en varios amplicones. Para reducir la variación en la calidad y la cantidad del producto de amplificación por PCR debido a la complejidad del genoma del guisante y la baja cantidad de ADN genómico utilizado en la PCR, se realiza una PCR anidada. Las mutaciones se detectan en las dianas amplificadas utilizando la endonucleasa ENDO1 específica del desajuste, como se describió anteriormente [28]. Las líneas mutantes individuales se identifican después de un paso de desconvolución de grupo, y luego la base mutada se identifica mediante secuenciación.

Un objetivo principal en un proyecto de mutagénesis es generar un recurso saturado donde cada locus está mutado y representado por múltiples alelos. Para evaluar la existencia de múltiples alelos por locus, analizamos las mutaciones en el gen de la metiltransferasa 1 del guisante (PsMet1) [29]. Se cultivaron tres amplicones de 1.383, 1.310 y 1.149 pb (Figura 4) y se identificaron 96 mutantes (Figura 5). El análisis de secuencia de las mutaciones mostró que 6 eran mutaciones intrónicas, 37 silenciosas, 50 sin sentido y 3 sin sentido (Figura 4b). Aunque la caracterización de PsMet1 mutantes está más allá del alcance de este artículo, encontramos que la recuperación de los alelos mutantes de las reservas de semillas M3 de la planta A fue exitosa, sin la necesidad de utilizar reservas de semillas M3 de respaldo recolectadas de las plantas hermanas B (Figura 1). Los mutantes exónicos estaban presentes en su mayoría como heterocigotos (79 de 90 mutaciones), pero 11 líneas eran homocigotas para las mutaciones. Como se esperaba con la mutagénesis de EMS, estas mutaciones se distribuyeron de manera relativamente uniforme dentro de los amplicones seleccionados (Figura 4b).

Comparación entre mutaciones predichas y obtenidas. (a) Salida del programa CODDLE usando como ejemplo el PsMetI secuencia genómica. Los exones están representados por recuadros blancos y los intrones por líneas rojas. El programa CODDLE se utilizó para identificar aquellas regiones del gen en las que es más probable que las transiciones de G: C a A: T produzcan efectos nocivos sobre la proteína codificada (representada por la curva de probabilidad trazada en turquesa). El algoritmo CODDLE se basa en una evaluación de la conservación de la secuencia de proteínas a partir de la comparación de accesiones de bases de datos de proteínas homólogas. Para PsMetI, se eligieron tres fragmentos basándose en estos resultados de CODDLE (líneas azules). Se diseñaron cebadores externos e internos para amplificar cada región mediante PCR anidada. (B) Representación gráfica de mutaciones identificadas en las tres regiones del gen. PsMetI. Este dibujo se realizó utilizando el programa PARSESNP [43], que mapea la mutación en un modelo genético para ilustrar la distribución de mutaciones. Los triángulos morados representan mutaciones silenciosas y los triángulos negros y rojos representan mutaciones sin sentido y de truncamiento, respectivamente.

Pantalla de labranza. Ejemplo de PsMetI TILLING en ADN de guisante combinado ocho veces. La imagen de la reacción de escisión se recoge de ambos canales (tintes IRD700 e IRD800). Los tamaños de los productos de escisión (marcados con un círculo) de las dos hebras de ADN marcadas con colorante (rojo o verde) se suman al tamaño del producto de PCR de longitud completa (parte superior del gel). Los artefactos de PCR se distinguen de los mutantes verdaderos por puntos amarillos (rojo y verde agregados) ya que aparecen en el mismo tamaño en ambos canales. El tamaño del producto de escisión (la escala de tamaños se puede ver a la izquierda y en el medio de la imagen) indica aproximadamente dónde se encuentra el polimorfismo de un solo nucleótido en el fragmento.

Para evaluar más a fondo la calidad de la población mutante, ampliamos la pantalla TILLING a otros 19 genes e identificamos 371 mutaciones puntuales en esos genes (Tabla 3). Como era de esperar para EMS, todas las mutaciones fueron transiciones G: C a A: T [6, 30]. Las mutaciones inducidas descubiertas en los exones consistieron en un 66,75% de mutaciones sin sentido, un 28,51% silenciosas y un 4,74% de mutaciones de parada (Tabla 4). Aunque el número de mutaciones sin sentido observadas fue mayor que la cantidad predicha por CODDLE (63,80%), recuperamos las mutaciones de parada en una proporción ligeramente inferior a la predicha (6,90%). Como muchos amplicones cultivados albergan segmentos intrónicos, algunas mutaciones recuperadas fueron intrónicas. Aunque algunos de estos podrían afectar potencialmente la eficiencia del empalme de ARNm, tal impacto es impredecible. Por tanto, los mutantes intrónicos no se caracterizaron más. Por el contrario, el gran número de mutaciones no sinónimos recuperadas es de interés, ya que pueden dar lugar a fenotipos de ganancia o pérdida de función. Tales mutaciones también permitirán la disección de la función de la proteína con respecto a su estructura de subdominio.

Calculamos la frecuencia de mutación en los 20 genes diana (Tabla 3) según Greene et al. [6]: la frecuencia de mutación es igual al tamaño del amplicón multiplicado por el número total de muestras examinadas dividido por el número total de mutantes identificados. Estimamos que la tasa de mutación promedio es de una mutación cada 200 kb. Esta densidad de mutación es 1,5 veces mayor que la tasa de una mutación por 300 kb informada para Arabidopsis, la población mutante TILLING mejor caracterizada hasta la fecha [6]. Por lo tanto, la dosis de 16-24 mM de EMS utilizada para crear la población mutante de guisantes parece ser una dosis adecuada para TILLING. En promedio, identificamos 34 alelos por gen cultivado (después de la normalización a TILLING de toda la población). Teniendo en cuenta que aproximadamente la mitad de las mutaciones sin sentido deberían tener un efecto deletéreo en una proteína típica [31], 25 alelos por kilobase labrada serían suficientes para los análisis fenotípicos.

Configuración de la base de datos UTILLdb

Calificamos 4.817 líneas en la población mutante para alteraciones fenotípicas utilizando 107 subcategorías de fenotipos. En las pantallas de TILLING buscamos mutaciones en 20 genes e identificamos 467 alelos. Para gestionar e integrar los datos en expansión tanto de los registros de fenotipo como de los genes diana de TILLING, implementamos la base de datos UTILLdb. UTILLdb fue desarrollado de acuerdo con un sistema de base de datos relacional, interconectando cuatro módulos principales: líneas, categorías de fenotipos, secuencias y mutaciones. Se puede acceder a dos tipos principales de datos, los fenotipos morfológicos de los mutantes y las secuencias de los genes cultivados y los alelos correspondientes, cuando estén disponibles. UTILLdb se puede buscar usando una secuencia, a través de una herramienta BLAST [32] o para una característica fenotípica usando una búsqueda por palabra clave. El resultado de la búsqueda se muestra como una tabla de resultados que muestra el fenotipo de cada línea, con imágenes asociadas y secuencia mutada si existe. Por lo tanto, el usuario podría preguntarse si las líneas que comparten mutaciones en un gen específico comparten los mismos fenotipos y viceversa. Como esperamos que la caracterización fenotípica de los mutantes TILLING se vuelva más detallada a medida que los usuarios de UTILLdb los analicen, UTILLdb se diseñó para que los datos del pasaporte de las líneas mutantes se puedan ampliar o modificar según sea necesario. UTILLdb es de acceso público a través de una interfaz web [33]. Se implementa un enlace para facilitar el pedido de semillas. UTILLdb también sirve como punto de entrada para los usuarios que deseen cultivar su gen favorito en la plataforma Caméor TILLING. Los resultados de esas pantallas, así como el fenotipo de los mutantes identificados, se implementarán en UTILLdb.


3. Mutagénesis seleccionada por la diana

La mutagénesis seleccionada por diana se usa para identificar mutaciones en un gen específico de un genoma mutagenizado aleatoriamente. El enfoque implica mutagénesis estándar usando EMS o UV / TMP, por ejemplo, seguido de cribado usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otro método para identificar animales que portan lesiones en el gen de interés.

Dos consorcios comunitarios, el C. elegans Knockout Consortium (celeganskoconsortium.omrf.org) y el C. elegans El Proyecto Nacional de Fuentes Biológicas de Japón (NBRP, http://www.shigen.nig.ac.jp/c.elegans/mutants/index.jsp) está utilizando actualmente mutagénesis seleccionada por diana para identificar alelos mutantes para cada gen en el C. elegans el genoma C. elegans Deletion Mutant Consortium, 2012). Juntos, estos grupos han aislado más de 6700 alelos de deleción o nulos y están disponibles para la comunidad científica ( C. elegans Deletion Mutant Consortium, 2012). Cepas del C. elegans Knockout Consortium están disponibles en el Caenorhabditis Centro de genética (CGC, http://www.cbs.umn.edu/research/resources/cgc) bajo la designación de alelo OK o G k. Cepas generadas por el NBRP, con designación de alelo tm , están disponibles después de la presentación de un Acuerdo de transferencia de materiales (Mitani, 2009). Las cepas de deleción se enumeran en Wormbase, que debe consultarse primero para determinar si un alelo ya está disponible para un gen de interés. En caso contrario, se puede solicitar al Consorcio una cepa de eliminación. Al recibir una cepa, debe cruzarse para eliminar las mutaciones irrelevantes. Siempre es importante verificar la presencia de la mutación en una cepa. Además, las mutaciones por deleción obtenidas por selección de la diana pueden ir acompañadas de duplicaciones proximales, lo que da como resultado una heterocigosidad obligada para el gen en consideración. En estas situaciones, la evaluación fenotípica de la cepa mutante puede no revelar los defectos asociados con la pérdida completa del gen. Para confirmar que un gen de interés es responsable de un defecto observado, se deben realizar experimentos de rescate transgénico y / o examinar múltiples alelos ( C. elegans Deletion Mutant Consortium, 2012). Además de la colección de deleciones, el Million Mutations Project (http://genome.sfu.ca/mmp/) ha identificado más de 800.000 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y más de 16.000 indeles en más de 20.000 genes ( C. elegans Deletion Mutant Consortium, 2012 Thompson et al., 2013). Si bien algunos de estos SNP no afectan la función de los genes, muchos pueden proporcionar datos útiles de estructura y función.

3.1. Mutagénesis seleccionada en la diana mediante PCR

El objetivo de la mutagénesis seleccionada por el objetivo es generar una biblioteca que contenga grupos de animales mutagenizados que se puedan cribar en busca de lesiones específicas del ADN. Los alelos de deleción son más fáciles de identificar usando PCR que mutaciones puntuales, por lo que UV / TMP y EMS son los mutágenos preferidos (Lesa, 2006). Para la construcción de bibliotecas, 600.000 hermafroditas son mutagenizados aleatoriamente. Una vez que los animales mutagenizados se vuelven grávidos, se blanquean y se deja que los L1 eclosionen en M9, durante la noche. A continuación, los L1 se subdividen en 1152 subcultivos (placas NGM de 55 mm) de 500 animales cada uno. Después de dos generaciones de autofertilización, el 20% de los animales por placa se enjuagan para el aislamiento del ADN genómico en doce placas de 96 pocillos (Lesa, 2006). Los animales restantes se almacenan a 15 ° C durante hasta seis semanas. Aunque las bibliotecas se pueden congelar, las bibliotecas de animales vivos son menos propensas a fallas en la recuperación de mutantes (Lesa, 2006).

Normalmente se utilizan tres enfoques para buscar deleciones en un gen de interés: condiciones de PCR restringidas, cebadores de veneno y enzimas de restricción termoestables. Cada enfoque emplea cebadores de PCR anidados diseñados para flanquear la secuencia genómica de interés para aumentar la especificidad, y cada método favorece la amplificación de productos de deleción sobre productos de tipo salvaje más grandes (Edgley et al., 2002 Jansen et al., 1997 Wei et al., 2002 Zwaal et al., 1993). Todos estos métodos son propensos a altas tasas de falsos positivos (50% -90%), por lo tanto, cada muestra combinada debe examinarse por duplicado (Jansen et al., 1997). Un protocolo completo para la creación de bibliotecas y la técnica de PCR de cebadores venenosos está disponible en el capítulo de genética inversa en WormBook.

3.1.1. Tiempo de extensión de PCR restringido (Jansen et al., 1997)

Cada grupo de bibliotecas se incuba primero con un par de cebadores (10 pmol por cebador) diseñado con una separación de 2,5 a 3,5 kb sobre una región de interés, seguido de la incubación de una dilución 1: 500 de la primera PCR con un par de cebadores anidados (Liu et al. ., 1999). Después de la adición de polimerasa, nucleótidos y tampón, las muestras se ciclan con tiempos de extensión cortos (45 sa 1 min) para favorecer la acumulación del producto de deleción (Jansen et al., 1997). Las ADN polimerasas tienen tasas de renovación específicas (número máximo de nucleótidos polimerizados en un período de tiempo determinado), que varían según el tipo de Taq utilizado (Kornberg y Baker, 1992). Por ejemplo, si el producto de tipo salvaje (WT) es de 2 kb, el producto de deleción es de 500 pb y la polimerasa Taq tiene una tasa de rotación de 1 kb / min, se necesitarán aproximadamente dos minutos para completar la reacción de WT y 30 seg para el producto de eliminación. Si el tiempo de extensión se limita a 45 s, solo se amplificará el producto de eliminación. Durante muchas rondas, se amplifica algún producto WT, pero a una velocidad mucho más lenta que la eliminación. Esto aumenta enormemente las probabilidades de detectar el alelo de deleción menos abundante. Las deleciones detectadas son variables en extensión y promedian alrededor de 1,4 kb de tamaño (Liu et al., 1999). Las reacciones completadas se ejecutan en un gel de agarosa y se identifican los grupos que tienen un producto más pequeño que el producto de tipo salvaje. Los animales de biblioteca de este grupo se siembran en placas individualmente o en grupos más pequeños y se vuelven a analizar para identificar hermafroditas individuales que portan la lesión relevante (Jansen et al., 1997).

3.1.2. Método de imprimación venenosa (Edgley et al., 2002)

Este enfoque se desarrolló para enriquecer las deleciones que tienen un tamaño inferior a 500 pb (Edgley et al., 2002). El protocolo es similar al del método de tiempo de extensión de PCR restringido, excepto que se agrega un tercer cebador entre los cebadores externos de la primera PCR (Figura 3). Este cebador venenoso está diseñado para amplificar solo el ADN genómico de tipo salvaje, compitiendo con el producto de tipo salvaje de longitud completa, reduciendo así la cantidad de molde de tipo salvaje disponible para la segunda PCR. El segundo conjunto de cebadores anidados solo puede unir el producto eliminado y el producto de tipo salvaje de longitud completa, cuya concentración total se reduce a la mitad debido al producto de cebador venenoso. Esto conduce a un aumento de 500 veces en la sensibilidad al mejorar la proporción de deleciones con respecto a los productos de tipo salvaje. El uso de un tiempo de extensión corto (45 s) también facilita la síntesis del producto de deleción. Debido a que el cebador venenoso determina la ubicación de los productos de deleción amplificados, generalmente es mejor apuntar al extremo 5 & # 8217 de un gen para generar alelos nulos (Edgley et al., 2002).

Figura 3. Método de cebador venenoso para detectar deleciones. Esta técnica enriquece el ADN eliminado raro sobre el producto de tipo salvaje más abundante y completo. Los cebadores a, byp se utilizan en la primera PCR para generar una plantilla de tipo salvaje, una plantilla mutante y una plantilla & # 8216poison & # 8217. En la segunda PCR, estos productos se utilizan como plantilla con los cebadores a & # 8217 yb & # 8217 para aumentar la señal del producto eliminado. Sin el cebador de veneno, el producto de longitud completa domina la reacción de PCR y el producto de deleción está por debajo del límite de detección. Cuando se incluye el cebador de veneno, se reduce la amplificación total de longitud completa y se revela el producto de deleción.

3.1.3. Enzimas de restricción termoestables (Huang et al., 2006 Wei et al., 2002)

En este método menos utilizado, se identifican secuencias en un gen diana que tienen un sitio de reconocimiento de enzima de restricción termoestable en el intervalo que abarcan los pares de cebadores (Wei et al., 2002). Estas enzimas son estables a altas temperaturas, lo que las hace ideales para usar con PCR. El ADN genómico combinado se digiere durante 2 h antes de la PCR para escindir el ADN genómico y reducir la cantidad de molde de tipo salvaje disponible. Las enzimas también se incluyen durante las amplificaciones por PCR para escindir continuamente cualquier producto de tipo salvaje. Se utilizan dos juegos de cebadores anidados. Las secuencias de deleción dirigidas carecen del sitio de la enzima de restricción y no se escinden, lo que aumenta la sensibilidad de la reacción (Wei et al., 2002). Se han encontrado deleciones que varían de 330 pb a 1,7 kb usando este método (Huang et al., 2006 Wei et al., 2002). Las enzimas de restricción termoestables validadas incluyen Psp SOLDADO AMERICANO, Tli I, Bst Interfaz de usuario Mono KI y Cucharadita 45I (Huang et al., 2006 Wei et al., 2002).

3.2. Labranza

TILLING (Focalización de lesiones locales inducidas en genomas) permite la identificación de mutaciones puntuales y pequeños indeles en un gen de interés (McCallum et al., 2000). Desarrollado originalmente en Arabidopsis thaliana , TILLING usa una nucleasa de ADN monocatenario para determinar la ubicación de los desajustes después de hibridar un genoma mutado con un genoma no mutado (Colbert et al., 2001 Till et al., 2003). Si bien este método solo se ha utilizado una vez para aislar mutaciones puntuales en un gen de interés en C. elegans , se ha utilizado más en otros organismos. Mutaciones en una población de C. elegans se generan utilizando EMS o ENU (Gilchrist et al., 2006). La PCR dirigida a un gen de interés se realiza en ADN genómico derivado de muchos grupos de animales (Figura 4). Los imprimadores están etiquetados con diferentes fluoróforos, marcando los extremos 5 & # 8217 y 3 & # 8217 del producto con diferentes colores. Después de la PCR, se desnaturaliza el ADN de cada reacción. Luego, la reanimación permite la formación de heterodúplex entre el ADN mutante y el de tipo salvaje. El ADN recocido se incuba con una nucleasa de ADN de una sola hebra, CEL1, derivada del extracto de jugo de apio (CJE) (Till et al., 2004). CJE corta el ADN heterodúplex donde un desajuste o indel crea una protuberancia monocatenaria. Las muestras se procesan en geles LI-COR desnaturalizantes y los geles se examinan en ambos canales fluorescentes para determinar en qué grupo se produce un desajuste (Gilchrist et al., 2006). En un cribado de diez genes (que van desde 788 pb hasta 9,1 kb de tamaño), se identificaron 71 mutaciones. Of these, 59% constituted missense alleles, and 3% were nonsense alleles (Gilchrist et al., 2006).

Figure 4. TILLING allows identification of point mutations in pools of mutated DNA. Both mutated DNA and wild-type DNA are subjected to PCR, using differentially labeled 5’ and 3’ primers (here in green and red). The PCR products are denatured and reannealed slowly, so that heteroduplex DNA forms between a mutated DNA strand and a wild-type DNA strand. The reannealed PCR products are treated with Cel1, an enzyme that specifically cleaves heteroduplex DNA. The reaction is visualized on a LI-COR gel in two fluorescence channels. When heteroduplex DNA is cut, smaller DNA fragments are seen in both the green and red channels within the same lane. Full-length, uncut product will be prominent at the top of the gel.

Individual mutagenized F1 animals are plated singly onto 1500 seeded NGM plates. After the food supply is expended, half of the animals are frozen at 󔽘°C. The other half are used to generate genomic DNA individually into 96-well plates. To reduce the number of PCR reactions, eight F1 DNA samples are pooled together for analysis. Once a positive pool has been identified, DNA genomic samples are assayed individually to determine from which plate the sample originally arose. PCR primers are designed over an area of 1.5 kb, mainly encompassing exonic regions. Primers can be designed using the program CODDLE to select for regions high in G/C content, which are most prone to mutation by EMS (Gilchrist et al., 2006).

3.3. G4 DNA-induced deletion mutagenesis

The consensus sequence G3+norte1-7GRAMO3+norte1-7GRAMO3+ norte1-7GRAMO3+ pliegues in vitro to form a guanine quadruplex (G4) structure that may block replication en vivo (Kruisselbrink et al., 2008). The FANCJ protein (DOG-1 in C. elegans ) is a DNA helicase required for proper replication of such guanine-rich tracts (Kruisselbrink et al., 2008). En dog-1 mutants, these tracts are prone to 5’ deletions. There are more than 2,900 guanine quadruplex sites in the C. elegans genome, annotated in Wormbase under “G4 Motif” in GBrowse, and over 1,600 genes are located 5’ of a G4 site (Pontier et al., 2009). Of ten genes assayed in one study, 11 deletion alleles were generated, most of which were up to several kilobases upstream of the G4 site targeted (Pontier et al., 2009). This method has been used once to generate deletion alleles (Pontier et al., 2009).

dog-1(pk2247) mutants are picked to individual NGM plates and allowed to grow until no OP50 remains on the plate (Pontier et al., 2009). Half of the animals on each plate are rinsed off with M9 for genomic DNA isolation. Prior to DNA isolation, animals are split into two groups. If a deletion is present in only one of the samples, it probably arose from a somatic event. However, if a deletion is detected in both samples, it is most likely a heritable mutation (Pontier et al., 2009). Deletions are screened using any of the PCR protocols described above. After isolation, the strain is outcrossed to wild-type animals to remove the dog-1 mutation and any off-target deletions.


What is Forward Genetics?

Forward genetics can be defined as the path of determining the basis of genetics that is responsible for a particular phenotype. Naturally occurring mutations and mutants that are induced by radiation, chemicals or transposable elements (insertional mutagenesis) were the initial approaches for forward genetics. It is then followed by breeding, isolation of the mutant individuals and lastly the mapping of the gene. Forward genetics is performed to determine the gene function through the analysis of the phenotypic effects of DNA sequences that are altered. Therefore, it is considered antagonistic to reverse genetics. Mutant phenotypes are usually examined beforehand to identify the particular gene responsible and can give rise to genes being named after the respective mutant phenotype. Drosophila rosado gene named after the mutant’s eye color is an example.

In the context of conventional genetical approach, a researcher handling the determination process of the genetic basis for phenotypes would directly map the gene on the particular chromosome where it is present. This is done through cross-breeding with different individuals where those individuals carry different other uncommon traits. Statistical analysis will be carried out to determine the frequency of occurrence where the two traits are inherited together. This convention methodology of mapping takes a considerable long period of time.


Drosophila Models of Huntington Disease

LESLIE M. THOMPSON , J. LAWRENCE MARSH , in Animal Models of Movement Disorders , 2005

1. Screens

Genetic screens can identify mutations that lead to more severe (enhancers) or less severe (suppressors) phenotypes. Two types of mutations can be screened: loss-of-function alleles in which a mutation typically causes the activity of one allele to be lost, or gain-of-function alleles in which the mutation is caused by an insertion of a transposable P-element containing a UAS based enhancer and promoter (EP), resulting in ectopic activation of the gene in the presence of GAL4 drivers. Eye degeneration of a polyQ alone expressing fly model (UAS-127Q) was used in a P-element screen for modifiers of the phenotype [ 28 ]. Several modifiers were identified, highlighting a role for protein folding pathways (dHDJ1, dTPR2) and suggesting a possible association with pathways involved in cell proliferation and DNA replication (Drosophila homolog of human myeloid leukemia factor 1, MLF1) [ 29 ]. Using the SCA1 model to screen for suppressors and enhancers of the phenotype, several classes of modifier genes were identified. These included transcriptional regulating genes, protein modification genes, and chaperones as modifiers of mutant ataxin 1 pathology [ 25 ].


Genomic screening: A pet subject

Many canine inherited diseases are late onset conditions that are often not apparent until maturity. Breeders and owners must therefore wait until a puppy grows before knowing if it is affected. This delays vital preventive veterinary treatment and can result in breeding from affected animals, thus perpetuating the disease. Replacing this traditional approach with genomic screening is a much faster way to manage breed-specific problems genomic carrier status is easy to screen in young puppies, so breeders and owners do not have to wait for clinical signs before taking action.

Moreover, with more research, scientists are also finding that different gene mutations cause the same or similar diseases. For example, various genes associated with retinal function cause progressive retinal atrophy (PRA) and blindness in many dog breeds. Inheritance is mostly as an autosomal recessive gene (PRCDin many breeds, PDE6Bin the Irish setter, RD3in collies, and PDE6Ain cardigan Welsh corgis all cause rod-cone dysplasia), but in the Siberian husky and Samoyed the condition is due to RGPR, an X-linked gene, and autosomal dominance is the route for bullmastiffs and English mastiffs (RHO). Golden retrievers are affected by two different gene mutations (SLC4A3y TTC8) causing PRA. There is still a lot to learn about heritability and disease expression in dogs.


Materiales y métodos

Mutagenesis and breeding

ENU mutagenesis followed standard protocols (S tottmann and B eier 2010). In brief, 6- to 8-week-old A/J mice (Jackson Labs) were injected i.p. with a fractionated dose of ENU once weekly for 3 weeks with 90, 95, or 100 mg/kg ENU (Sigma). A/J mice were used due to their ability to tolerate larger doses of ENU with acceptable morbidity and mortality, thus increasing their mutation load and increasing productivity of the screen (W eber et al. 2000). ENU was prepared using standard methods and dissolved in ethanol. After allowing for a period of infertility following the mutagenesis, a standard three-generation breeding scheme was followed (B ode et al. 1988 H erron et al. 2002 also see Results and Figure 1 ). The A/J males were crossed with FVB/J females (Jackson Labs), retinoic acid response element (RARE)-lacZ–positive females, or Lis1 heterozygous females (largely from a 129 background). The resulting G2 females were backcrossed to generate G3 embryos or postnatal day (P) 14 pups. For timed pregnancies, successful matings were identified by the presence of a copulation plug, and noon of the day of detection was set as embryonic day (E) 0.5. All animals were housed in accordance with the Harvard Medical School Center for Animal Resources and Comparative Medicine.

ENU breeding scheme. (A) A traditional three-generation breeding scheme for recovering recessive traits in the third generation (G3). G0 males are mutagenized and outcrossed to generate the G1 population. These are again outcrossed to generate G2 females, which may carry any given ENU mutation. These are backcrossed to the G1 male to create the G3 generation, which is then screened for phenotype(s). Solid indicates homozygosity for an ENU mutation, open indicates no mutation, solid/open indicates heterozygosity. (B) Introduction of a reporter allele is accomplished by mating RARE-lacZ–positive animals to the G1 male and genotyping subsequent females for the transgene. (C) Similarly, a sensitizing locus is incorporated by mating Lis1 heterozygous females with G1 males.

Mouse genotyping

RARE-lacZ mice were genotyped with standard lacZ primers (F-TTTAACGCCGTGCGCTGTTCG, R-GATCCAGCGATACAGCGCGTC). Lis1 heterozygotes were identified using primers for the neomycin resistance cassette (F-TCCTGCCGAGAAAGTATCCATCAT, R-CCAGCCGGCCACAGTCGT) as previously described (H irotsune et al. 1998). Looptail mice carry a mutation in the vang-like 2 (Vangl2) gene, and heterozygous mice were identified by their abnormally looped tail. Direct sequencing of the mutation (in the eighth exon of vangl2) was done to genotype embryos (F-AGAGGATGAAGGGTGGGTG, R-GTGTCAGGGCCAGAGAACC).

Whole-genome single nucleotide polymorphism scanning

To map our mutations, we genotyped a custom whole-genome panel of 768 single nucleotide polymorphism (SNPs) with the Illumina GoldenGate technology at the Broad Institute Center for Genotyping and Analysis. A total of 256 of the 768 SNPs on this panel were polymorphic between A/J and FVB/J. The initial genomic interval carrying the mutation was defined by flanking SNPs, which identified a homozygous A/J haplotype shared by all affected animals. Fine mapping was done by analyzing further meioses with microsatellite markers, restriction fragment length polymorphisms [identified via the MGI database http://www.informatics.jax.org/strains_SNPs.shtml or the algorithm SNP2RFLP (B eckstead et al. 2008)], or direct sequencing of SNPs. Sequencing of candidate genes was done with standard methods, either exon-based sequencing or using random-primed cDNA from mutant RNA for transcript analysis. Primer design was either with Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) or via the Exon Primer function in the University of California at San Francisco (UCSC) Genome browser (http://genome.ucsc.edu/). All DNA sequencing other than SNP mapping was done at the Dana-Farber/Harvard Cancer Center DNA Resource Core. In two of these mutant lines, crn2 y hith2, our initial mapping was with a cohort of affected animals with multiple phenotypes and resulted in two candidate regions. Analysis of more embryos and standard microsatellite mapping demonstrated that not all phenotypes were allelic and allowed us to focus on the chromosomal location reported in Table 2 for mapping crn2 y hith2.

Tabla 2

NombrePhenotype descriptionCromosomaInterval (Mb)Locus
Brain dimple (brdp)Telencephalic dysmorphology mild hydrocephaly1315� (3)& # x02014
Cleft lip and palate, exencephaly (clpex)Cleft lip and palate, exencephaly781� (4)& # x02014
Cleft palate 1 (clft1)Cleft palate only1183� (10)Irf6
Rudolph (rud)Cortical dysmorphology, shortened long bones1160� (8)Hsd17b7
Craniorachischisis (crn2)Craniorachischisis1549� (4 a )Scrib
Progressive hydrocephalus (prh)Progressive hydrocephaly30� (4)& # x02014
Cleft face (clft3)Midline fusion defect, small brain, encephalocele150� (4)& # x02014
Hole in the head 2 (hith2)Encephalocele, hydrocephalus836� (4 a )Casp3

Eight monogenic mutations were recovered in this screen. The causal gene or initial mapping interval from the whole-genome SNP scan is reported with the number of mutants used in parentheses.

Histology and immunohistochemistry

Histological analysis used standard methods (N agy 2003). Embryos were fixed in either Bouin's fixative or 4% paraformaldehyde followed by paraffin embedding and sectioning at 14 μm. Sections were stained with hematoxylin and eosin or Cresyl violet. Caspase-3 immunohistochemistry was performed on paraffin sections following the manufacturer's instructions using reagents described below. After deparaffinization of the slides, antigen retrieval was performed with Citra Buffer (Biogenex). Blocking against background from avidin𠄻iotin immunohistochemistry was done with commercial reagents (DAKO, Vectorlab). Slides were incubated with a primary antibody against full-length caspase-3 (Cell Signaling) overnight at 4° at 1:200. Visualization was with a biotin-labeled secondary antibody (Vectastain Universal ABC kit) and counterstained with hematoxylin QS (Biogenex).

Análisis de crn2 cochlear phenotype

E18 whole-mount cochleae were fixed in 4% paraformaldehyde, dissected to expose the sensory epithelium, and stained with Alexa Fluor-conjugated phalloidin (1:200 Invitrogen). Images shown are confocal projections of the cochlear sensory epithelium. Absolute rotation of hair-cell stereocilia bundles was assessed at positions of 5, 25, and 50% of the total cochlear length from the basal end of the duct, as previously described (M ontcouquiol et al. 2003). Data are presented as the average deviation from 0° error bars represent SEM. Significant differences were determined by two-tailed t-prueba.


Supporting information

S1 Fig. Wolbachia recovers from severe titre reduction within four fly generations.

Relative Wolbachia titres of the progeny of tetracycline-treated flies. wMelCS_b-carrying females laid eggs in food containing varying doses of tetracycline. The progeny of three females were used to set up the experiment. At the first generation, four females were randomly selected for egg-laying in antibiotic-free fly food and Wolbachia titre was measured using qPCR. Titres of untreated females were used to normalize the qPCR results. The progeny of a female with the median titre was used to set up the next generation. Wolbachia titre in the F1 was significantly determined by the concentration of the antibiotic (pag < 0.001 for all doses compared with control at generation 1), but recovered to normal within four fly generations (pag > 0.05 for all doses compared with control at generation 4).

S2 Fig. EMS decreases female fecundity and Wolbachia titre in the next generation in a dose-dependent manner.

The total number of eggs (A) and adults (B) from females treated with varying doses of EMS. The reproductive output of 10 females was determined in the first ten days after EMS treatment by daily transferring females to new vials for egg laying. Females fed on a sucrose solution served as controls. Each dot represents the total number of eggs (A) or adults (B) laid by individual females during ten days. The effect of EMS on the reproductive output of females was estimated using a non-linear model and was highly significant (pag < 0.001 for both numbers of eggs and adults per female). (C and D) Wolbachia titres in the F1 progeny of females treated with varying EMS doses. Wolbachia titre was quantified on individual females (n = 5–13 per dose), after laying eggs for three days. Wolbachia titres were normalized against the titres of untreated females. Dashed red lines represent the mean value predicted using non-linear models. The effect of EMS on Wolbachia titres in the next generation was highly significant (pag < 0.001 for both panels).

S3 Fig. Isolation of over-proliferative Wolbachia variants.

(A-D) Relative Wolbachia titres in a control (wMelCS_b) and EMS-treated D. melanogaster líneas. Flies to set up the next generation was selected as described for Fig 1. Line 2B was isolated in the same batch as Line 2A (wMelOctoless) and they may be not independent. Likewise, Lines 3A (wMelOctoless2), 3B, and 3C were also isolated in a same batch.

S4 Fig. Generation of isogenic D. melanogaster lines with wMelPop2 and wMelOctoless.

The first, second and third chromosomes of flies carrying wMelPop2, wMelOctoless, and wMelOctoless2 were replaced through the use of balancer chromosomes. Wolbachia infection (and also mitochondria) was kept in the stock by crossing females with Wolbachia with indicated males. The mitochondria are only shown in females because of its strictly maternal transmission. All males were free of Wolbachia infección. Dashed lines indicate the genotype selected from the previous cross. Virgin female in the first cross were considered mutant in all chromosomes (*), for illustrative purposes. Question marks (?) represent recombined chromosomes.

S5 Fig. Proliferation of wMelOctoless and wMelOctoless2 in a host isogenic genetic background.

Relative Wolbachia titres in D. malanogaster males carrying wMelOctoless and wMelOctoless2 at 0 and 7 days post adult eclosion, at 25°C. This experiment was set-up as described in Fig 1. Relative Wolbachia titre was determined using qPCR and normalized to that of 0–1 days-old wMelCS_b-infected males. Each dot represents the relative titre of a single male.

S6 Fig. Confirmation of amplification and deletion of Octomom genes by qPCR.

The amplification and deletion of individual Octomom genes (wMel loci WD0507WD0514) was confirmed using qPCR in wMelPop2 and wMelOctoless, respectively. The copy number of three genes outside the Octomom region (wMel loci WD0505, WD0519, y rpoD) were also determined. Five females carrying wMelCS_b, wMelPop2, and wMelOctoless were used in the analysis. El número de copia de wMelPop2 and wMelOctoless genes is relative to that of wMelCS_b.

S7 Fig. Selection for lines carrying Wolbachia with a desired Octomom copy number.

The relative copy number of genomic WD0513 en Wolbachia-carrying stocks throughout 30 fly generations. Each generation, 5–20 females were randomly collected for egg-laying for 3–4 days and used to determine the relative copy number of WD0513, as a proxy for the Octomom copy number. The progeny of a single female was used to set up the next generation. qPCR results were normalized to that of wMelCS_b, which has a single copy of Octomom per genome.

S8 Fig. Octomom region is amplified in tandem in wMelPop2 and wMelPop.

Oxford Nanopore MinION reads supporting the amplification of the Octomom region in tandem in wMelPop2 and wMelPop Wolbachia variants. We mapped wMelPop2 and wMelPop long reads (BioProject: PRJNA587443) to the the Octomom region in their genomes (Accessions CP046922.1 and CP046921.1, respectively) using minimap2 v2.17-r941 [48] and plotted the alignment summary (S7 Table) for illustrative purposes.

S9 Fig. Identification of the genetic bases for over-proliferation of the Wolbachia in Line 2B and Line 3A (wMelOctoless2).

Relative coverage in the genomic region containing the Octomom region. As in Fig 2B, Illumina paired-end reads were mapped to wMelCS_b (GenBank: CP046924.1) genome, and the number of reads mapping to each position were normalized by dividing to the median coverage across the genome. Coverage information for wMelCS_b, wMelPop2 and wMelOctoless is also given in Fig 2B. We identified the deletion of Octomom as the cause of proliferation in lines 2B and line 3A (wMelOctoless2), as no other difference was found when compared to wMelCS_b.

S10 Fig. The amplification or deletion of Octomom increase Wolbachia proliferation rate in adults.

Time-course of relative Wolbachia titres in adults at 18°C (A), 25°C (B) and 29°C (C) with different Wolbachia variants. Replicate of experiment shown in Fig 3. Wolbachia titres were determined and analysed as described for Fig 3.

S11 Fig. Octomom copy number determines Wolbachia titres on the day of adult eclosion.

Relative Wolbachia titres on the day of adults eclosion. Males developed at 25°C were collected within 24 hours after eclosion for Wolbachia titre measurement using qPCR. Data used in this figure are also shown in Fig 3 and S10 Fig (time point 0). Letters represent significant groups after pag-value correction.

S12 Fig. wMelPop2 and wMelPop are phenotypically indistinguishable.

(A) WD0513 copy number of wMelPop2 and wMelPop in two experimental replicates. Utilizando WD0513 as a proxy, the Octomom copy number of wMelPop2 and wMelPop was tightly controlled prior to phenotypic comparison. (B) Wolbachia relative titres at 25°C. The progeny of wMelPop2- and wMelPop-infected females carrying three copies of Octomom was used to set up the experiments. Males that developed at 25°C were collected upon eclosion, aged to specific time-points and used to determine Wolbachia titres using qPCR. Wolbachia titres were normalized to that of wMelCS_b-carrying flies collected on the day of eclosion. Proliferation rates of wMelPop2 and wMelPop were not different (pag = 0.32). (C) Lifespan of males (solid lines) and females (dashed lines) flies at 25°C. Males were transferred to new vials every five days, while females every four days. (D) Coefficients of a Cox mixed model, representing the effect of wMelPop2 and wMelPop on the lifespan relative to wMelCS_b-carrying flies. wMelPop2 and wMelPop was equally pathogenic (p = 0.29).

S13 Fig. Octomom copy number dynamics throughout fly development and during adult life.

Relative copies of WD0513 a lo largo de D. melanogaster development (A) and during adult life (B). WD0513 relative copy numbers were determined in samples shown in Fig 4 (for panel A) and Fig 3 and S10 Fig (for panel B). WD0513 copies were normalized to that of 0–1 old wMelCS_b-infected males. (A) Vertical dashed lines separate developmental stages (i.e. eggs, larvae, pupae, and adults). The x-axis is not in a continuous scale. (B) The two replicates are represented by different symbols.

S14 Fig. wMelPop2 and wMelOctoless are pathogenic to both males and females.

Lifespan of D. melanogaster males at 18°C (A), 25°C (B), and 29°C (C). Survivorship was determined as in Fig 5. This is a replicate of Fig 5. (D) Survival of D. melanogaster females at 25°C. Survival was determined as in Fig 5, except that females were transferred to new vials every four days. The experiment was performed twice. (E) Coefficients of a Cox mixed model of the lifespan of females relative to Wolbachia-free control. Both replicate experiments were pooled for statistical comparisons. Bars represent the standard error of the coefficient, and letters the statistically significant groups.

S15 Fig. Wolbachia variants, not differences in the host genetic background, are pathogenic.

(A-B) Survival of D. melanogaster females at 29°C. Virgin wMelCS_b-carrying females were crossed with males carrying wMelOctoless or wMelPop2 (with 3 or 8–9 Octomom copies) and vice-versa. The resulting progeny developed at 25°C and was placed at 29°C after adult eclosion. The survival of 50 female progeny, which have the same genetic background but differ in Wolbachia infection, was determined per condition, per replicate. Females were maintained in groups of ten and transferred to new vial every four days. The experiment was performed twice. (C) Coefficients of a Cox mixed model representing the effect of the parental crosses on the survivorship of females. Significance was accessed after p-value correction for multiple comparisons, and significant groups are represented by letters.

S16 Fig. Correlation between Wolbachia-induced phenotypes and bacterial titres or doubling time.

(A-C) Correlation between Wolbachia titre at the day of eclosion and the strength of life-shortening phenotype determined at 18°C (A), 25°C (B), and 29°C (C). The y-axis represents the strength of Wolbachia life-shortening phenotype (estimated using Cox mixed model shown in Fig 5). The x-axis represents the natural log of the relative Wolbachia titre estimated using a linear mixed model. Bacterial titres were normalized to that of wMelCS_b-infected flies (shown in S11 Fig). (D and E) The correlation between the strength of anti-viral protection and Wolbachia doubling time. The y-axis represents the strength of anti-viral protection (estimated using Cox mixed model shown in Fig 6). The x-axis represents Wolbachia doubling time in adults at 18°C (D), or 25°C (E) (shown in Table 1). The Pearson correlation coefficient (r) and its significance (p) are given in each panel. A grey line represents the trend (fit of linear regression). Error bars represent the standard errors of the estimates. None of these correlations were statistically significant and they complement correlations shown in Fig 5 and Fig 6.

S17 Fig. Survival of flies with different Wolbachia variants after challenge with DCV or buffer solution.

(A) Survival of males carrying different Wolbachia variants after a challenge with DCV (A) or a buffer solution (B and C). Fifty 3–5 days-old Drosophila males, per line, were pricked with DCV (10 9 TCID50/ml) or buffer and survival curves were determined at 18°C for 40 days. A is a replicate of Fig 6A, 6B and 6C are controls for these experiments. (D) Coefficients of Cox mixed models of buffer-pricked flies. Both replicates were pooled for statistical analysis. Bars represent the standard error of the estimate, and the letters the statistically significant groups after p-value correction.

Tabla S1. Number of F1 females screened for new over-proliferative Wolbachia variants per experimental condition.

wMelCS_b-infected G0 females, raised in control or antibiotic-treated food (12.5 μg/ml), were fed different doses of ethyl-methanesulfonate (EMS) and allowed to lay eggs in individual vials. F1 females were collected as virgins, mated to non-mutagenized males and also allowed to lay eggs individually. F1 females were used for Wolbachia titre measurement when were 10-days old. Number of F1 females tested per experimental condition is shown.

Tabla S2. Coverage statistics of the sequencing project.

Coverage statistics (mean and range) of Illumina reads mapped to either Wolbachia or mitochondria of D. melanogaster Release 6 genome sequence (KJ947872.2:1–14,000). Sequencing data of each Wolbachia variants are mapped to own genome assembly (BioProject ID: PRJNA587443), except for Wolbachia in Line 2B and wMelOctoless2 which were mapped to wMelCS_b genome (Accession: CP046924.1). ND–not determined.

S3 Table. Flies infected with new over-proliferative Wolbachia variants did not inherit mutated mitochondria.

Illumina reads on flies infected with different Wolbachia variants were mapped to the mitochondria of D. melanogaster Release 6 genome sequence (KJ947872.2:1–14,000). A summary of the mapping is given in S2 Table. The mitogenome of flies infected with wMelCS_b, wMelOctoless and wMelPop2 was identical. We found an SNP unique to flies infected with wMelCS-like variants (G→A on position 10,793) but absent in flies infected with wMelPop. We confirmed this SNP using Sanger sequencing.

S4 Table. Assembly and annotation statistics.

Wolbachia genomes were assembled using the Unicycler v0.4.8-beta pipeline and annotated using NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline v4.10. wMel reference genome (Accession: AE017196.1) is included for comparison purposes.

S5 Table. SNPs and indels between newly assembled wMel and wMel reference genome.

The genome of a newly assembled Cluster III wMel Wolbachia variant (Accession: CP046925.1) was aligned to wMel reference genome (Accession: AE017196.1) using Mauve v2.4.0. All the differences were confirmed via Sanger sequencing.

S6 Table. SNPs and indels between wMelCS_b and and wMel reference genome.

El genoma de wMelCS_b (Accession: CP046924.1) was aligned to wMel reference genome (Accession: AE017196.1) using Mauve v2.4.0.

S7 Table. Alignment summary of long reads supporting the amplification of the Octomom region in tandem.

Long reads (MinION, Oxford Nanopore) reads supporting the amplification of the Octomom region in tandem in wMelPop2 (Accession: CP046922.1) and wMelPop (Accession: CP046921.1) genomes. Long reads were mapped to Octomom region using minimap2 v2.17-r941 and the number of Octomom copies determined using blastn v2.8.1+.

S8 Table. Primers used for amplification and quantification of individual Wolbachia genes.

Primers used in this study have been previously described [16,17].

S9 Table. List of primers used to improve Wolbachia draft genomes.

Primers used to amplify and sequence, using Sanger technology, genomic regions containing predicted differences between Wolbachia draft genomes.

S1 Text. Confirmation of the amplification and deletion of the Octomom in wMelPop2 and wMelOctoless, respectively.

Los genomas de wMelCS_b, wMelPop2 and wMelOctoless were aligned using Mauve v2.4.0. The three-fold amplification of Octomom in wMelPop2 and its deletion in wMelOctoless were the only difference identified when compared with wMelCS_b.


Ver el vídeo: Variabilidade genética (Septiembre 2022).


Comentarios:

  1. Vilhelm

    Perdón por no poder participar en la discusión en este momento, estoy muy ocupado. Pero seré libre, definitivamente escribiré lo que pienso en este tema.

  2. Rye

    Te equivocas. Vamos a discutir. Escríbeme en PM, hablaremos.

  3. Darragh

    Esta es una condicionalidad común

  4. Wielladun

    Me gustaría hablar mucho contigo.

  5. Kamlyn

    Estoy totalmente de acuerdo con usted. Hay algo en esto y creo que es una gran idea. Estoy completamente de acuerdo contigo.



Escribe un mensaje