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¿Se encuentran plásmidos en eucariotas?

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Hay quienes dicen que los plásmidos se encuentran en algunos eucariotas, pero ¿está científicamente probado?


Estos recursos pueden ayudar.

Este libro, "Plásmidos de eucariotas", explica que ...

“Durante mucho tiempo, la posesión de plásmidos solo se reconoció en las bacterias. Ahora es evidente que los plásmidos, o formas replicativas de ADN estructural y experimentalmente comparables a los plásmidos bacterianos, también existen en organismos eucariotas. De hecho, estos plásmidos son comunes entre los hongos y las plantas superiores ".

Además, este sitio web (ScienceDirect) explica que ...

“La mayoría de los plásmidos habitan en bacterias y, de hecho, alrededor del 50% de las bacterias que se encuentran en la naturaleza contienen uno o más plásmidos. Los plásmidos también se encuentran en organismos superiores como levaduras y hongos. El círculo de levadura de 2 micrones (discutido más adelante) es un ejemplo bien conocido que ha sido modificado para su uso como vector de clonación ".


¿Se encuentran plásmidos en eucariotas? - biología

Un plásmido es una pequeña molécula de ADN que está físicamente separada y puede replicarse independientemente del ADN cromosómico dentro de una célula.

Objetivos de aprendizaje

Resume la utilidad de los plásmidos

Conclusiones clave

Puntos clave

  • Los plásmidos se pueden encontrar en los tres dominios principales: Archaea, Bacteria y Eukarya. Al igual que los virus, algunos no consideran que los plásmidos sean una forma de vida.
  • Los plásmidos proporcionan un mecanismo para la transferencia horizontal de genes dentro de una población de microbios y, por lo general, proporcionan una ventaja selectiva en un estado ambiental dado.
  • Los plásmidos pueden portar genes que brindan resistencia a los antibióticos naturales en un nicho ambiental competitivo, o las proteínas producidas pueden actuar como toxinas en circunstancias similares.

Términos clave

  • plásmido: Un círculo de ADN de doble hebra que está separado de los cromosomas, que se encuentra en bacterias y protozoos.
  • mobilome: La totalidad de los elementos móviles (transponibles) de un genoma.
  • replicones: una región de ADN o ARN, que se replica a partir de un único origen de replicación.

En microbiología y genética, un plásmido es una molécula de ADN que está separada y puede replicarse independientemente del ADN cromosómico. Son de doble hebra y, en muchos casos, circulares. Los plásmidos suelen aparecer de forma natural en bacterias, pero a veces se encuentran en arqueas e incluso en organismos eucariotas (p. Ej., El anillo de 2 micrómetros en Saccharomyces cerevisiae).

Paso a paso de la clonación de un gen usando un plásmido: Esta imagen muestra un dibujo lineal que compara la actividad de los plásmidos no integrantes, en la parte superior, con los episomas, en la parte inferior, durante la división celular. La mitad superior de la imagen muestra una bacteria con su ADN cromosómico y plásmidos dividiéndose en dos bacterias idénticas, cada una con su ADN cromosómico y plásmidos. La mitad inferior de la imagen muestra una bacteria con su ADN cromosómico, pero con un episoma. Junto a esta bacteria, vemos la misma bacteria, pero después de que el episoma se haya integrado en el ADN cromosómico y se haya convertido en parte de él. Esta segunda bacteria ahora se divide en dos bacterias idénticas a ella, cada una con un episoma integrado.

Los tamaños de los plásmidos varían de 1 a más de 1000 kpb. El número de plásmidos idénticos en una sola célula puede oscilar entre uno y miles en algunas circunstancias. Los plásmidos pueden considerarse parte del mobiloma porque a menudo se asocian con la conjugación, un mecanismo de transferencia horizontal de genes.

El término plásmido fue introducido por primera vez por el biólogo molecular estadounidense Joshua Lederberg en 1952.

Los plásmidos se consideran replicones y se pueden encontrar en los tres dominios principales: Archaea, Bacteria y Eukarya. Al igual que los virus, algunos no consideran que los plásmidos sean una forma de vida. A diferencia de los virus, son ADN desnudo y no codifican los genes necesarios para encerrar el material genético para su transferencia a un nuevo huésped, aunque algunas clases de plásmidos codifican el pilus sexual necesario para su propia transferencia. La transferencia de plásmido de huésped a huésped requiere una transferencia mecánica directa por conjugación o cambios en la expresión del gen del huésped incipiente que permitan la captación intencional del elemento genético por transformación. La transformación microbiana con ADN plasmídico no es de naturaleza parasitaria ni simbiótica, porque cada una implica la presencia de una especie independiente que vive en un estado comensal o perjudicial con el organismo huésped. Más bien, los plásmidos proporcionan un mecanismo para la transferencia horizontal de genes dentro de una población de microbios y, por lo general, proporcionan una ventaja selectiva en un estado ambiental dado. Los plásmidos pueden portar genes que brindan resistencia a los antibióticos naturales en un nicho ambiental competitivo, o las proteínas producidas pueden actuar como toxinas en circunstancias similares. Los plásmidos también pueden proporcionar a las bacterias la capacidad de fijar nitrógeno elemental o degradar compuestos orgánicos recalcitrantes que proporcionan una ventaja cuando los nutrientes son escasos.


Características del ADN eucariótico en comparación con el ADN procariótico

Se sabe que las células procariotas son mucho menos complejas que las células eucariotas, ya que se considera que las células eucariotas están presentes en un punto posterior de la evolución. Es probable que las células eucariotas hayan evolucionado a partir de células procariotas. Las diferencias de complejidad se pueden ver a nivel celular.

La única característica necesaria y suficiente para definir un organismo como eucariota es un núcleo rodeado por una envoltura nuclear con poros nucleares. Todos los eucariotas existentes tienen células con núcleos, la mayor parte de una célula eucariota y el material genético rsquos está contenido dentro del núcleo. Por el contrario, el ADN procariótico no está contenido dentro de un núcleo, sino que está unido a la membrana plasmática y contenido en forma de nucleoide, una región de forma irregular que no está rodeada por una membrana nuclear.

Figura ( PageIndex <1> ): Ubicación celular del ADN eucariota y procariota: El ADN eucariota se almacena en un núcleo, mientras que el ADN procariota está en el citoplasma en forma de nucleoide.

El ADN eucariota se empaqueta en haces de cromosomas, cada uno de los cuales consta de una molécula de ADN lineal enrollada alrededor de proteínas básicas (alcalinas) llamadas histonas, que enrollan el ADN en una forma más compacta. El ADN procariótico se encuentra en forma circular, no cromosómica. Además, los procariotas tienen plásmidos, que son piezas más pequeñas de ADN circular que pueden replicarse por separado del ADN genómico procariota. Debido a la naturaleza lineal del ADN eucariota, las secuencias repetidas de ADN no codificantes llamadas telómeros están presentes en ambos extremos de los cromosomas como protección contra el deterioro.

La mitosis, un proceso de división nuclear en el que los cromosomas replicados se dividen y separan utilizando elementos del citoesqueleto, está universalmente presente en los eucariotas. El citoesqueleto contiene componentes estructurales y de motilidad llamados microfilamentos y microtúbulos de actina. Todos los eucariotas existentes tienen estos elementos citoesqueléticos. Los procariotas, por otro lado, se someten a una fisión binaria en un proceso en el que el ADN se replica, luego se separa en dos polos de la célula y, finalmente, la célula se divide por completo.

Una de las principales diferencias de ADN entre eucariotas y procariotas es la presencia de ADN mitocondrial (ADNmt) en eucariotas. Debido a que los eucariotas tienen mitocondrias y los procariotas no, las células eucariotas contienen ADN mitocondrial además del ADN contenido en el núcleo y los ribosomas. El ADNmt está compuesto por un número significativamente menor de pares de bases que el ADN nuclear y codifica solo unas pocas docenas de genes, dependiendo del organismo.


Plásmidos: definición, tipos y replicación | Microbiología

En este artículo discutiremos: - 1. Definición de plásmidos 2. Naturaleza física y número de copias de plásmidos 3. Propiedades 4. Incompatibilidad 5. Tipos 6. Replicación 7. Curado de plásmidos 8. Uso de plásmidos como vectores de conos.

Definición de plásmidos:

Además del cromosoma bacteriano (nucleoide), las células bacterianas normalmente contienen elementos genéticos en su citoplasma. Estos elementos genéticos existen y se replican por separado del cromosoma y se denominan plásmidos. La existencia misma de plásmidos en el citoplasma bacteriano fue revelada por Lederberg en 1952 mientras trabajaba en el proceso de conjugación en bacterias.

Lederberg acuñó el término & # 8216plasmid & # 8217 para referirse a los elementos genéticos transmisibles que se transfirieron de una célula bacteriana a otra y determinaron la masculinidad de las bacterias.

Literalmente, ahora se conocen miles de plásmidos, se han aislado más de 300 plásmidos naturales diferentes de cepas de Escherichia coli sola. Además de los plásmidos naturales, se han desarrollado muchos plásmidos modificados artificialmente y se han utilizado como vectores en el proceso de clonación de genes (ingeniería genética).

Naturaleza física y número de copias de plásmidos:

La naturaleza física de los plásmidos es bastante simple. Son pequeñas moléculas de ADN de doble hebra. La mayoría de los plásmidos son circulares, pero también se conocen muchos plásmidos lineales.

Los plásmidos de origen natural varían en tamaño desde aproximadamente 1 kilobase hasta más de 1 megabase, y se considera que un ADN plásmido típico tiene menos del 5% del tamaño del cromosoma bacteriano. La mayor parte del ADN plasmídico aislado de células bacterianas existe en la configuración de superenrollamiento, que es la forma más compacta de ADN que existe dentro de la célula.

El número de copias se refiere al hecho de que diferentes plásmidos ocurren en las células en diferentes números. Algunos plásmidos están presentes en la célula en solo 1-3 copias, mientras que otros pueden estar presentes en más de 100 copias. El número de copias está controlado por genes en el plásmido y por interacciones entre el huésped y el plásmido.

Propiedades de los plásmidos:

(i) Son específicos de una o unas pocas bacterias en particular.

(ii) Se replican independientemente del cromosoma bacteriano.

(iii) Codifican para su propia transferencia.

(iv) Actúan como episomas y se integran reversiblemente en el cromosoma bacteriano.

(v) Pueden recoger y transferir ciertos genes del cromosoma bacteriano,

(vi) Pueden afectar ciertas características de la célula bacteriana,

(vii) Los plásmidos se diferencian de los virus en dos aspectos.

(viii) No causan daño a las células y generalmente son beneficiosos.

(ix) No tienen formas extracelulares y existen dentro de las células simplemente como ADN libre y típicamente circular.

Incompatibilidad de plásmidos:

En algunos casos, una sola célula bacteriana contiene varios tipos diferentes de plásmidos. Borrelia burgdorferi que causa la enfermedad de Lyme, por conveniencia, posee 17 plásmidos circulares y lineales diferentes.

En una condición en la que un plásmido se transfiere a una nueva célula bacteriana que ya posee otro plásmido, se observa comúnmente que el segundo plásmido (transferido) no se acomoda y se pierde durante la replicación posterior.

Esta condición se llama incompatibilidad de plásmidos y se dice que los dos plásmidos son incompatibles. Se han reconocido varios grupos de incompatibilidad de plásmidos en bacterias. Los plásmidos de un grupo de incompatibilidad se excluyen entre sí de la replicación en la célula, pero generalmente coexisten con plásmidos de otros grupos.

Los plásmidos de un grupo de incompatibilidad comparten un mecanismo común de regular su replicación y, por lo tanto, están relacionados entre sí. Por lo tanto, aunque una célula bacteriana puede poseer varios tipos de plásmidos, cada uno es genéticamente distinto.

Tipos de plásmidos:

Varios tipos de plásmidos se encuentran naturalmente en las células bacterianas, y la clasificación más favorecida de tales plásmidos se basa en sus funciones principales codificadas por sus propios genes.

A continuación se muestran los principales tipos de plásmidos reconocidos sobre la base del rasgo característico mencionado anteriormente:

1. Plásmido F (o factor F):

El plásmido F o factor F (& # 8220F & # 8221 significa fertilidad) es el plásmido muy bien caracterizado. Desempeña un papel importante en la conjugación en la bacteria E. coli y fue el primero en ser descrito. Es este plásmido el que confiere & # 8216 masculinidad & # 8217 a las células bacterianas. El término "factor sexual" también se utiliza para referirse al plásmido F debido a esta propiedad. El plásmido F es una molécula de dsDNA circular de 99.159 pares de bases.

El mapa genético del plásmido F se muestra en la figura 5.31. Una región del plásmido contiene genes involucrados en la regulación de la replicación del ADN (genes rep), la otra región contiene elementos transponibles (genes IS3, Tn 1000, IS3 e IS2) involucrados en su capacidad para funcionar como un episoma, y ​​la tercera región grande La región, la región tra, consta de genes tra y posee la capacidad de promover la transferencia de plásmidos durante la conjugación. Ejemplo de plásmido F de E. coli.

Los plásmidos R son el grupo de plásmidos más extendido y mejor estudiado que confieren resistencia (de ahí que se denominen plásmidos resistentes) a los antibióticos y a otros inhibidores del crecimiento.

Los plásmidos R generalmente tienen genes que codifican enzimas capaces de destruir y modificar antibióticos. Por lo general, no están integrados en el cromosoma del huésped. Algunos plásmidos R poseen un solo gen resistente mientras que otros pueden tener hasta ocho.

El plásmido R 100, por ejemplo, es un plásmido de 94,3 kilopares de bases (fig. 5.32) que porta genes resistentes para sulfonamidas, estreptomicina y espectinomicina, cloranfenicol, tetraciclina, etc. También porta genes que confieren resistencia al mercurio.

Muchos plásmidos R son conjugados y poseen genes resistentes a los fármacos como elementos transponibles; desempeñan un papel importante en la microbiología médica, ya que su propagación a través de poblaciones naturales puede tener profundas consecuencias en el tratamiento de infecciones bacterianas.

Los plásmidos de virulencia confieren patogénesis a la bacteria huésped. Hacen que la bacteria sea más patógena ya que la bacteria es más capaz de resistir las defensas del huésped o producir toxinas.

Por ejemplo, los plásmidos Ti de Agrobacterium tumefaciens inducen la enfermedad de las agallas de la corona de las plantas angiospérmicas. Las cepas entertoxigénicas de E. coli causan diarrea del viajero debido a un plásmido que codifica una enterotoxina que induce una secreción extensa de agua y sales en el intestino.

Los colplásmidos portan genes que confieren a la bacteria huésped la capacidad de matar otras bacterias secretando bacteriocinas, un tipo de proteínas. Las bacteriocinas a menudo matan las células creando canales en la membrana plasmática aumentando así su permeabilidad. También pueden degradar el ADN o ARN o atacar al peptidoglicano y debilitar la pared celular.

Las bacteriocinas actúan solo contra cepas estrechamente relacionadas. El plásmido Col E1 de E. coli codifica la síntesis de bacterioeína llamadas colicinas que matan a otras cepas susceptibles de E. coli. Los plásmidos col de algunas E. coli codifican la síntesis de bacteriocina, a saber, cloacinas que matan las especies de Enterobacter.

Las bacterias del ácido láctico producen la bacteriocina NisinA que inhibe fuertemente el crecimiento de una amplia variedad de bacterias grampositivas y se utiliza como conservante en la industria alimentaria.

5. Plásmidos metabólicos:

Los plásmidos metabólicos (también llamados plásmidos degradativos) poseen genes para codificar enzimas que degradan sustancias inusuales como tolueno (compuestos aromáticos), pesticidas (ácido 2, 4-diclorofenoxiacético) y azúcares (lactosa).

El plásmido TOL (= pWWO) de Pseudomonas putida es un ejemplo. Sin embargo, algunos plásmidos metabólicos que se encuentran en ciertas cepas de Rhizobium inducen la formación de nódulos en leguminosas y llevan a cabo la fijación de nitrógeno atmosférico.

En la tabla 5.2 se ofrece un breve resumen de los tipos importantes de plásmidos bacterianos, sus huéspedes y sus propiedades.

Replicación de plásmidos:

Los plásmidos se replican de forma autónoma porque tienen sus propios orígenes de replicación. Las enzimas involucradas en la replicación de plásmidos son enzimas de células normales, particularmente en el caso de plásmidos pequeños. Sin embargo, algunos plásmidos grandes llevan genes que codifican enzimas que son específicas para la replicación del plásmido.

Los plásmidos poseen relativamente pocos genes, generalmente menos de 30, y los genes están relacionados principalmente con el control del proceso de iniciación de la replicación y con la distribución de los plásmidos replicados entre las células hijas.La información genética contenida en los genes del plásmido no es esencial para el huésped porque la bacteria que carecen de ellos suelen funcionar con normalidad.

Dado que el ADN plasmídico es de pequeño tamaño, todo el proceso de su replicación se lleva a cabo muy rápidamente, quizás en 1/10 o menos del tiempo total del ciclo de división celular.

La mayoría de los plásmidos en bacterias gramnegativas se replican de una manera similar a la replicación del cromosoma bacteriano que implica la iniciación en el sitio de origen de la replicación y la replicación bidireccional alrededor del círculo de ADN dando un intermedio theta (Ө).

Sin embargo, algunos plásmidos de bacterias gramnegativas se replican mediante un método unidireccional. La mayoría de los plásmidos de bacterias grampositivas se replican mediante un mecanismo de círculo rodante similar al utilizado por el fago φx174. La mayoría de los plásmidos lineales se replican por medio de un mecanismo que involucra una proteína unida al extremo 5 & # 8242 de cada hebra de ADN que se usa para cebar la síntesis de ADN.

Curado de plásmidos:

Los plásmidos se pueden eliminar de las células bacterianas y este proceso se denomina curado. El curado puede tener lugar de forma espontánea o puede ser inducido por varios tratamientos, que inhiben la replicación del plásmido pero no afectan la replicación del cromosoma bacteriano ni la reproducción celular. Los plásmidos inhibidos se diluyen lentamente de la creciente población bacteriana.

Algunos agentes de tratamiento de curado comúnmente usados ​​son tintes de acridina, radiación ultravioleta (UV) e ionizante, inanición de timina y crecimiento por encima de las temperaturas óptimas. Estos agentes de tratamiento curativo interfieren con la replicación del plásmido que con la replicación del cromosoma bacteriano.

Uso de plásmidos como vectores de clonación:

La importancia de los plásmidos aumentó drásticamente con el advenimiento de la tecnología del ADN recombinante, ya que se convirtieron en los primeros vectores de clonación, e incluso hoy en día son los vectores de clonación más utilizados, especialmente en la clonación de genes en bacterias.

Disfrutan de este estado porque tienen propiedades muy útiles como vectores de clonación que incluyen:

(i) Tamaño pequeño, lo que hace que el plásmido sea fácil de aislar y manipular.

(ii) Origen de replicación independiente, que permite que la replicación del plásmido en la célula proceda independientemente del control cromosómico directo.

(iii) Número de copias múltiples, lo que hace que estén presentes en la célula en varias copias para que la amplificación del ADN plasmídico sea fácil y

(iv) Presencia de marcadores seleccionables, como genes de resistencia a antibióticos, que facilitan la detección y selección de clones que contienen plásmidos.

El vector plasmídico se aísla de la célula bacteriana y en un sitio mediante la enzima de restricción. La escisión convierte el ADN plasmídico circular en una molécula de ADN lineal.

Ahora los dos extremos abiertos del plásmido lineal se unen a los extremos del ADN extraño para insertarse con la ayuda de la enzima ADN ligasa. Esto regenera un plásmido híbrido circular o quimérico, que se transfiere a una bacteria en la que se replica y perpetúa indefinidamente.

Uno de los plásmidos más utilizados en la clonación de genes en bacterias es el pBR322, que tiene genes de resistencia a ampicilina y tetraciclina y muchos sitios de restricción. Cuando se inserta un ADN extraño en el gen de resistencia a la ampicilina de pBR322, el plásmido ya no puede conferir resistencia a la ampicilina.


Plásmidos de eucariotas

Autores: Esser, K., Kück, U., Lang-Hinrichs, C., Lemke, PAG., Osiewacz, H.D., Stahl, U., Tudzynski, PAG.

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La posesión de plásmidos se reconoció durante mucho tiempo solo en las bacterias. Ahora es evidente que los plásmidos, o formas replicativas de ADN estructural y experimentalmente comparables a los plásmidos bacterianos, también existen en organismos eucariotas. De hecho, estos plásmidos son comunes entre los hongos y las plantas superiores. La presente revisión se realiza para proporcionar una descripción completa de los datos disponibles sobre plásmidos que se encuentran en organismos eucariotas. Esta revisión no considerará plásmidos de origen procariota, aunque ciertos plásmidos bacterianos, como los plásmidos inductores de tumores (Ti) de Agrobacterium tumefaciens, pueden estar íntimamente asociados con la transformación del huésped eucariota. Este libro, además, no considera los experimentos de transformación en huéspedes eucariotas que involucran ADN viral como vectores, aunque de hecho dichos vectores se han desarrollado para su uso en sistemas vegetales y animales. Después de una introducción general, que proporciona una perspectiva histórica sobre la naturaleza y el papel de los plásmidos, se presentará una lista de plásmidos eucariotas según su origen. A esto le sigue una discusión detallada de la estructura y función conocidas. En capítulos posteriores se discutirán las implicaciones prácticas de los plásmidos eucariotas para la clonación molecular y la biotecnología. Esta última parte rastrea el desarrollo del interés en la genética biotecnológica y da una consideración especial al uso de sistemas eucariotas para la clonación de genes. La terminología genética biotecnológica se introduce al lector y se utiliza en un sentido general como equivalente a la ingeniería genética. La genética biotécnica incluye, pero no se limita a, la clonación de genes mediante tecnología de ADN recombinante.


Ribosomas

Toda la vida celular sintetiza proteínas y los organismos de los tres dominios de la vida poseen ribosomas, estructuras responsables de la síntesis de proteínas. Sin embargo, los ribosomas en cada uno de los tres dominios son estructuralmente diferentes. Los ribosomas, en sí mismos, se construyen a partir de proteínas, junto con ARN ribosómico (ARNr). Los ribosomas procarióticos se encuentran en el citoplasma. Se llaman ribosoma 70S.s porque tienen un tamaño de 70S (Figura ( PageIndex <7> )), mientras que los ribosomas citoplasmáticos eucariotas tienen un tamaño de 80S. (La S significa unidad Svedberg, una medida de sedimentación en una ultracentrífuga, que se basa en el tamaño, la forma y las cualidades de la superficie de la estructura que se analiza). Aunque son del mismo tamaño, los ribosomas bacterianos y de arquea tienen diferentes proteínas y moléculas de ARNr, y las versiones de arqueas son más similares a sus contrapartes eucariotas que a las que se encuentran en las bacterias.

Figura ( PageIndex <7> ): Los ribosomas procariotas (70S) se componen de dos subunidades: la 30S (subunidad pequeña) y la 50S (subunidad grande), cada una de las cuales está compuesta por componentes de proteína y ARNr.


Tipos de células de hongos

Los dos tipos principales de células de hongos son células de levadura (hongos unicelulares) y células de hifas (las células individuales de hongos filamentosos multicelulares).

Células de hifas

Las hifas son estructuras filiformes ramificadas que se encuentran en hongos filamentosos multicelulares. Una sola hifa consiste en una larga cadena de células tubulares de hifas, que están unidas y divididas por paredes internas llamadas septa. Las hifas crecen desde sus puntas, lo que permite que los filamentos se extiendan y se ramifiquen en nuevos sustratos. Las hifas liberan enzimas digestivas en el sustrato, que lo descomponen en nutrientes que el hongo puede absorber.

Las hifas se reproducen asexualmente mediante un proceso llamado fragmentación. Durante la fragmentación, pequeños trozos de hifas pueden desprenderse y crecer para formar una nueva colonia de células fúngicas.

Células de levadura

Las levaduras son hongos unicelulares que se reproducen asexualmente por en ciernes. Durante este proceso, el núcleo de la célula de levadura se divide por mitosis y se forma una yema en la superficie de la célula. Con el tiempo, la yema se desprenderá para convertirse en una nueva célula hija genéticamente idéntica.

La brotación produce pseudohifas células alargadas, recién formadas que se asemejan a hifas. A diferencia de las hifas verdaderas, las pseudohifas están formadas por células de levadura unidas pero individuales que se separan fácilmente unas de otras. Las células de las hifas verdaderas son partes de un organismo multicelular y están fusionadas por tabiques.


Fondo

Los arrecifes de coral están coloreados por proteínas fluorescentes (FP) y cromoproteínas (CP) que constituyen una familia de proteínas eucariotas homóloga con la FP verde medusa (GFP) [1, 2]. Estos homólogos de GFP son pequeñas proteínas codificadas cada una por un solo gen, comprenden un porcentaje relativamente alto de proteínas solubles en los tejidos expresados ​​y forman su cromóforo sin necesidad de cofactores o sustratos distintos del oxígeno. Tales propiedades facilitaron su clonación e ingeniería para revolucionar las imágenes in vivo. A diferencia de los FP, los CP absorben intensamente la luz visible para dar colores claramente visibles bajo la luz ambiental y casi todos tienen baja fluorescencia [1, 2].

Las propiedades de absorción de CP confieren a los CP ciertas ventajas sobre los FP, como la detección visual sin instrumentos, la extinción eficiente de FRET y la formación de imágenes fotoacústicas [3, 4]. La detección de FP requiere una lámpara de luz ultravioleta (UV), un fluorómetro o un citómetro de flujo y puede estar limitada por la fluorescencia de fondo, el fotoblanqueo y el daño de la muestra por los rayos UV. Un reportero genético popular alternativo, el grupo de genes lux, requiere un luminómetro para su detección. La detección de CP también es ventajosa sobre los ensayos colorimétricos tradicionales como lacZ, que requieren un sustrato costoso añadido exógenamente y pueden estar limitados por el fondo de la enzima endógena [5]. Por lo tanto, los PC son particularmente atractivos como marcadores en organismos vivos [6, 7, 8], para la competencia y enseñanza internacional anual de máquinas de ingeniería genética (iGEM) [9], como reemplazos de tintes, para el arte y para aplicaciones de biosensores celulares en el campo. donde los costos y los bajos recursos son consideraciones importantes. Los métodos actuales para detectar contaminantes ambientales, agrícolas y alimentarios, minas terrestres y agentes de guerra biológica y objetivos de importancia médica pueden mejorarse mediante la biología sintética [10]. Por ejemplo, los bacteriófagos han sido diseñados para causar bioluminiscencia de bacterias patógenas en los alimentos, y las bacterias han sido diseñadas para emitir fluorescencia tras la detección de gas de carne en mal estado [11], productos de trinitrotolueno (TNT) [12] o arsénico [13]. La adaptación de estos biosensores a la detección no fluorescente para su uso en supermercados o en el campo atrae, pero no está claro qué genes CP podrían ser adecuados o cuál es la mejor manera de analizarlos cuantitativamente.

Si bien la familia GFP es nativa de los eucariotas, la mayoría de las aplicaciones a corto plazo previstas de las PC requieren una expresión eficiente en bacterias como E. coli donde la ingeniería es más sencilla. Esta expresión heteróloga eficiente a menudo requiere la optimización de codones, un proceso en su mayoría propietario que es aún más un arte que una ciencia, que requiere validación en cada caso [14]. Algunos genes de PC están disponibles comercialmente, pero los artículos se han descontinuado sin previo aviso (por ejemplo, fwYellow) y carecen de la caracterización y la disponibilidad gratuita asociadas con la publicación. Los CP de ATUM cuestan $ 225 / gen [15] y contienen sitios de restricción no deseados ("ilegales") que interfieren con el método de clonación de BioBrick popular y estandarizado [16], mientras que nuestros CP disponibles a través del Registro de Partes Biológicas [16] incurren en su cuota anual de $ 500. Además, así como se necesitaban comparaciones de PF para determinar qué PF eran mejores para la ingeniería y para determinadas aplicaciones [17], es necesario comparar los PC y mejorar sus propiedades y ensayos.

Las publicaciones de PC hasta la fecha no han informado sobre la toxicidad de las células bacterianas y normalmente se centran en un PC individual ([2, 15, 18,19,20,21,22] en la Tabla 1), haciendo un estudio de las propiedades relativas de las PC y sus genes difíciles. De los 11 genes CP no sintéticos enumerados en las siete columnas de la derecha de la Tabla 1, todos se expresaron únicamente a partir de sus secuencias de ADN eucariotas nativas, y solo se informó que cuatro se expresaron y maduraron lo suficiente en E. coli para dar colonias de colores intensos (asPink, amilGFP, aeBlue y amilCP). Por lo tanto, consideramos que, para algunos de los otros siete genes CP nativos, la optimización de codones de las secuencias eucariotas para coincidir E. coli las preferencias pueden ser necesarias para una alta expresión funcional en bacterias. Aquí, para simplificar y expandir el estudio y las aplicaciones de CP, ponemos a disposición 14 genes de CP diseñados que se expresan, caracterizan y comparan funcionalmente en E. coli, junto con mutantes cromosómicos adecuados para ensayos de competición.


¿Qué es el ADN cromosómico?

El ADN cromosómico es el ADN genómico. Tanto el genoma eucariótico como el procariótico se organizan en cromosomas. El genoma procariótico solo contiene un cromosoma, que es circular. Por otro lado, el genoma eucariota contiene varios cromosomas, que son lineales. Cada cromosoma contiene un origen de replicación y los cromosomas eucariotas contienen más de un origen de replicación debido a su gran tamaño. El ADN cromosómico siempre es de doble hebra.

Figura 2: ADN cromosómico

El número de un tipo particular de cromosoma en el genoma depende del tipo de especie. Sin embargo, la mayoría de los genomas de la tierra son diploides y contienen dos copias de un tipo particular de cromosoma. Dado que el ADN cromosómico representa el genoma de un organismo en particular, la información en los genes del ADN cromosómico es necesaria para el crecimiento, desarrollo y reproducción del organismo.


Métodos

Bases de datos

Los homólogos de las endonucleasas HUH se recuperaron ejecutando búsquedas contra bases de datos de secuencias de proteínas filtradas al 50 y 90% de identidad de secuencia (UniRef50 y UniRef90, respectivamente) que se descargaron de http://www.uniprot.org. La búsqueda de homólogos bacterianos de CRESS-DNA virus Reps se realizó contra nr90 (la base de datos nr de NCBI (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/) se filtró al 90% de identidad). Para detectar la similitud de secuencias remotas, utilizamos bases de datos de perfiles de secuencias que incluían perfiles de PDB (www.pdb.org), SCOP 69, Pfam 70 y CDD 71. Para la generación de perfiles de consulta se utilizó la base de datos nr70.

Búsquedas de secuencia y agrupación

Se obtuvieron homólogos de los dominios de endonucleasa de la superfamilia HUH para cada secuencia Rep representativa realizando tres iteraciones jackhmmer 72 contra la base de datos UniRef50. Se seleccionaron representantes representativos como consultas para búsquedas de homología basadas en una revisión exhaustiva de la literatura sobre la superfamilia HUH 16,17,28,53. Además, para los grupos HUH con menos de 10 homólogos en UniRef50, repetimos las búsquedas en la base de datos UniRef90. Para las búsquedas de homología, solo se usó el dominio de endonucleasa HUH para evitar atraer proteínas no relacionadas, por ejemplo, que contienen dominios de helicasa de la superfamilia 1 o 3. Sin embargo, la agrupación se realizó utilizando secuencias completas para reflejar mejor su historia evolutiva. El conjunto de datos obtenido mediante búsquedas en las bases de datos de UniRef se complementó con CRESS-DNA virus Reps desprovisto de secuencias recombinantes obvias de nuestro estudio anterior 53. Las secuencias se agruparon utilizando CLANS con la opción 35 de BLAST. CLANS es una implementación del algoritmo de diseño dirigido por fuerza de Fruchterman-Reingold, que trata las secuencias de proteínas como masas puntuales en un espacio virtual multidimensional, en el que se atraen o repelen entre sí en función de la fuerza de sus similitudes por pares (CLANS pag-valores) 35. Por lo tanto, las secuencias evolutivamente más estrechamente relacionadas gravitan hacia las mismas partes del mapa, formando grupos distintos. Los clústeres de representantes fueron identificados por el algoritmo convexo CLANS en PAG-valor = 1e − 08. Para recopilar homólogos bacterianos de CRESS-DNA virus Reps, utilizamos secuencias representativas como consultas y realizamos dos iteraciones jackhmmer contra la base de datos nr90. El conjunto resultante de secuencias se agrupó mediante un algoritmo de agrupamiento convexo (en PAG-valor = 1e − 05) en CLANES. Para asegurarnos de que reunimos todos los homólogos bacterianos, se construyeron perfiles HMM para cada grupo identificado y se utilizaron como consultas para búsquedas contra nr90 con hmmsearch 72. Las accesiones de proteínas para cada grupo, que se muestran en la Fig. 1, están disponibles para su descarga (Datos suplementarios 1). Para la recopilación del conjunto de datos de helicasa SF3, el dominio de helicasa de un miembro del supergrupo YLxH de Streptococcus canis (WP_003048523) se utilizó como una consulta para la búsqueda de hmmer contra la base de datos nr30 disponible en el servidor de Bioinformatics Toolkit 73. El conjunto de datos resultante se complementó con secuencias de helicasa SF3 de los virus CRESS-DNA 53, poliomavirus, papilomavirus, parvovirus y P. pulchra-como plásmidos (Datos suplementarios 1). Los dominios de helicasa extraídos se filtraron hasta un 70% de identidad con CD-HIT (parámetro “-c 0,7”) 74.

Detección remota de homología

Se utilizaron búsquedas de secuencia basadas en comparaciones de perfil-perfil para detectar homología remota. Para la generación del perfil, se ejecutaron dos iteraciones de jackhmmer 72 contra la base de datos de secuencia nr70 usando el valor E = 1e-03 umbral de inclusión. Los perfiles resultantes se utilizaron para buscar en las bases de datos de perfiles con HHsearch 75. Los resultados de la búsqueda de proteínas de plásmidos bacterianos representativos y elementos integradores están disponibles en Datos suplementarios 1.

Múltiples alineaciones de secuencias y análisis filogenético.

Para construir múltiples alineaciones de secuencia para el análisis filogenético, utilizamos MAFFT 76 y TrimAl 77. Las opciones MAFFT G-INS-i y L-INS-i y los umbrales de separación TrimAl 0.05 y 0.15 se utilizaron para generar alineaciones para las Figs. 2 y 5, respectivamente. Las alineaciones resultantes cubrieron tanto los dominios HUH como SF3 (cuando estuvieran disponibles) y contenían 743 y 508 posiciones, respectivamente. Ambas alineaciones se pueden encontrar en los datos suplementarios 2 y 3. Los árboles filogenéticos se calcularon con PhyML 78 utilizando la selección automática del modelo y el soporte de una rama de Bayes. Modelos de sustitución VT + G + I + F (VT, matriz de reemplazo de aminoácidos G, parámetro de forma gamma: estimado (1.864) I, proporción de sitios invariables: estimado (0.005) F, frecuencias de equilibrio: empírico) y LG + G (LG , matriz de sustitución de aminoácidos G: estimados (1,807)) se seleccionaron modelos de sustitución para los análisis filogenéticos mostrados en las Figs. 2 y 5, respectivamente. Se construyeron árboles adicionales usando IQ-Tree v1.6.8 (ref. 79) con el soporte de rama Ultrafast Bootstrap Approximation 80, y RAxML con bootstrapping no paramétrico 81. El árbol del modelo de mezcla se construyó con IQ-Tree 79 utilizando parámetros del modelo (LG + C20 + F + G) y bootstrap ultrarrápido (con 1000 repeticiones). La alineación y el árbol guía (parámetros “-s” y “-ft”, respectivamente) fueron los mismos que en la Fig. 5. Las secuencias muy divergentes que forman ramas largas se eliminaron antes de construir los árboles finales. Bacilladnaviridae viruses were also removed, because their position was not stable in trees with different sequence sampling (Supplementary figure 6). Phylogenetic trees are available from the authors upon request. The trees shown in Figs. 2, 5, S5 and S6 can be found in the Supplementary Data 4 to 10.

Pruebas estadísticas

Alternative topologies for the Rep tree were tested using the IQ-Tree software version 1.6.8 with the following parameters: -m LG+G -n 0 -zb 100000 -zw -au (ref. 79 ). As an unconstrained tree, we used the original PhyML tree (Fig. 5), which was tested against each of the constrained trees. The following tests were performed: Approximately Unbiased (AU) test 82 , logL difference from the maximal logl in the set, RELL test 83 , one sided and weighted Kishino–Hasegawa (KH) tests 84 , Shimodaira–Hasegawa (SH) test 85 , weighted SH test, Expected Likelihood Weight (ELW) test 86 .

Sequence logos

Sequence logos for the Reps of CRESS-DNA virus families were taken from ref. 57 . Alignments for other groups were obtained from an alignment used to build the tree shown in Fig. 5. Sequence logos were created using WebLogo server 87 .

Genomic context analysis

The integrated plasmids were identified by thorough analysis of genomic neighborhoods of the Rep-encoding genes. The precise borders of integration were defined based on the presence of direct repeats corresponding to attachment sites. The repeats were searched for using Unipro UGENE 88 . Genes of integrated plasmids were annotated based on the HHsearch searches 75 . Genome maps were compared and visualized using Easyfig with tBLASTx option 89 .

Resumen de informes

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.


Packaging of DNA, Genome, chromosomal proteins, DNA in Prokaryotes & Eukaryotes

Prokaryotes are living organisms whose genetic material is not surrounded by a nuclear membrane, but found free in the cytoplasm such as bacteria, DNA molecules of mitochondria and chloroplasts (organelles of eukaryotic cells) are very similar to those of prokaryotes, Plasmids are found in the yeast cells (from eukaryotes).

DNA in Prokaryotes

DNA of Escherichia coli bacterium as an example for prokaryotes:

  1. DNA exists as a double helix with its ends joined to each other to form a circle.
  2. If DNA was stretched out in a straight line, it would be about 1.4 millimeters in length, whereas the cell itself is only about 2 micron in length.
  3. DNA is folded many times and occupied a nuclear area about 0.1 of the cell’s volume.
  4. DNA molecule is attached to the plasma membrane at one point or more.

Some bacteria contain one or several additional, much smaller and circular DNA molecules which are called “plasmids”, Plasmids are much smaller circular DNA molecules and not complexed with proteins.

Importance of plasmids: Plasmids are widely used in the field of genetic engineering, where the bacterial cell replicates any plasmid inside it during the replication of its main DNA and the scientists take advantage of this activity by introducing artificial plasmids into the bacterial cells, in order to obtain several copies of them.

Packaging of DNA

DNA in Eukaryotes

Eukaryotes are living organisms whose genetic material is surrounded by a nuclear membrane that separates it from the cytoplasm and DNA is organized into several chromosomes, The human’s somatic cell contains 46 chromosomes, Chromosomes appear in eukaryotic cells during the cell division.

Structure of chromosomes

Each chromosome contains a single DNA molecule, extending from one end of the chromosome to the other end, DNA molecule is coiled and folded many times and associated with various proteins, forming a “chromatin” which contains roughly equal amounts of DNA and proteins.

Chromatin is one molecule of DNA that is coiled and folded many times and associated with proteins, The chromosomal proteins are divided into Histone proteins and Non-histone proteins.

Histone proteins

Histones are a well-defined group of small structural proteins, where they have a high content of the basic amino acids “arginine” and “lysine” and present in great amounts in the chromatin of any cell.

At the normal pH of the cell, the amino acids “arginine” and “lysine” have a positively charged alkyl groups (R), So, they bind strongly to the negatively charged phosphate groups of DNA molecule, Histones proteins are responsible for shortening the DNA molecule tenfold by forming a string of nucleosomes.

Non-histone proteins

Non-histones are heterogeneous groups of structural and regulatory proteins with many functions found in the structure of chromatin and they present in a little amount, Non-histone proteins have many different functions because they contain :

  • Structural proteins enter in the structure of some definite parts of DNA molecule and play the main role in the spatial organization of DNA within the nucleus as they are responsible for shortening DNA about 100,000 times by forming the packed chromatin.
  • Regulatory proteins determine whether the DNA code will be used in making RNA, proteins and enzymes or not.
Packaging of DNA

If we imagine that DNA double helix of each chromosome was lined up and stretched out, it would be about 2 metres in length, The histones and other proteins are responsible for packing this long molecule into the cell’s nucleus that of 2 : 3 micron in diameter.

Steps of DNA packaging

Biochemical analysis and electron micrographs have shown that DNA is packed, as follows:

  1. DNA is wounded around clusters of histones, forming a string of particles that is called “nucleosomes”, this shortens the molecule about tenfold, but it must be packed about 100,000 times more tightly to fit into the nucleus.
  2. The string of nucleosomes is coiled to pack the nucleosomes together, However, even this is not sufficient to shorten the DNA molecule to the required length.
  3. The tightly coiled strings of nucleosomes are arranged in large loops that are held together by the structural non-histone proteins to form the chromatin, Chromatin is packed up as tightly as possible to be condensed into the chromosome.

Nucleosomes are a string of particles that found in the chromosomes and consist of DNA molecule wounded (wrapped) around clusters of histones to shorten the DNA molecule about tenfold.

When DNA is packed as chromatin, replication enzymes apparently can’t reach it, This packaging must be unwounded at least into a string of nucleosomes before DNA can serve as a template for DNA or RNA synthesis.

Structure of the genome

In 1977, researchers found methods that can be used for determining the sequence of nucleotides in DNA and RNA molecules, This provided the tools to describe precisely how genes are arranged within the cell’s DNA molecule, Genome is the total of all genes ( all DNA) found in the cell.

DNA contains genes that carry instructions to construct the :

  • The sequence of nucleotides that is responsible for making proteins.
  • The sequence of nucleotides that transcribes the ribosomal RNA (rRNA) which enters the building of ribosomes.
  • The sequence of nucleotides that transcribes the transfer RNA (tRNA) which carries the amino acids during protein synthesis.

The genes in prokaryotes are the genes that are responsible for the RNA and protein synthesis and represent most of the genome.

The genes in eukaryotes: less than 70% of the genome serve the function of RNA and protein synthesis and the rest of the genome is unaccounted ( has unknown function).

Repetitive DNA

Most genes are present in only one or few copies in the genome, such as:

Genes needed to synthesize the ribosomal RNA and histones that the cell needs in large amounts, where they are reasonable to suppose that having multiple copies of these genes to speed up the cell’s production of new ribosomes and histones, So, there are many -often hundreds- of copies of the genes in all the eukaryotic cells.

Some nucleotides sequences of DNA have been repeated many times, The role of most of this repetitive DNA is still unclear, For instance, in the fruit fly (Drosophila), the brief nucleotides sequence (A-G-A-A-G) is repeated about 100,000 times in the middle of one chromosome, This and many other repeated sequences are noncoding DNA.

Other noncoding DNA

The satellite DNA of some chromosomes is noncoding, Eukaryotic genomes contain a great deal of other noncoding DNA, where the geneticists observe that the amount of DNA in species’ genome bears little relationship to the complexity of the organism or the number of proteins that is produced by it, Little amount of DNA of the plants and animals actually codes for protein synthesis.

Example: The largest known genome belongs to the salamander, its cells contain about 30 times the amount of DNA found in the human cells, although they produce fewer proteins, this is due to the noncoding of a large amount of DNA.

Functions of noncoding DNA:

  1. Perhaps some of the noncoding DNA act on keeping the chromosomes structure.
  2. Some regions of DNA are references to the places at which the messenger RNA (mRNA) synthesis should start and these regions are important in the protein synthesis.

We can compare between prokaryotic DNA and eukaryotic DNA, as follows:

Prokaryotic DNA

It exists as a double helix, its ends are joined together, it is attached to the plasma membrane at one point or more and it is not organized in the form of chromosomes, It is found in the cytoplasm (not surrounded by the nuclear membrane), It is not complexed with proteins.

The most are coding, It starts from the attachment point with the plasma membrane, Plasmids present and not complexed with proteins, Most of them are responsible for making the RNA and proteins.

Eukaryotic DNA

Eukaryotic DNA exists as a double helix, its ends are free and it is organized in several chromosomes, It is found in the nucleus (surrounded by the nuclear membrane), It is complexed with histone and non-histone proteins.

Some are non-coding, It starts at any point along the DNA molecule, Plasmids present in the yeast only, Less than 70% serve the function of RNA and protein synthesis and the rest of the genome is unaccounted (has unknown function).


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